人基因治疗申报临床试验指导原则
1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以后，国内外基因治疗的临床前及临床研究进展很快。为了我国基因治疗的正常开展管理，特起草本指导原则，作为申报人基因治疗临床试验的试行办法。凡国内单位以及国外单位或中外合资单位所研制的人基因治疗制剂在我国境内进行临床研究，均须按本指导原则进行申报和审批。
Ⅰ引言
基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于非生殖细胞。基因治疗的申报范围，是将外源基因或遗传物质导入人体细胞以达到防治疾病的目的，不包括应用化学药物改变基因表达。后者应纳入化学药物治疗的申报范围。
基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为离体基因导入后进入体内（exvivo）及体内导入（invivo）两种形式。前者是在体外将基因导入细胞，然后将细胞导入人体；后者则是将基因通过适当的导入系统直接用于人体。所用导入系统包括病毒与非病毒型。因此，申报资料不可能用一个模式来概括，必须按方案及其技术路线而异。本指导原则只可能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体申报的内容。根据国内外基因治疗的进展，基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险性，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。为此，希申请者加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终制品的制备，务必制订标准操作规程，并予严格实施。
Ⅱ申报资料内容
一、基因治疗制剂简介
（一）申请表（见附表）
（二）国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果：
1.应提供国内及国外已开展的同样或同类疗法的资料，包括所选择的病种、有效性、安全性及必要性。须着重指出申请方案与国外或国内已批准的方案的不同处、特点及其优越之处。凡属新的方案，应说明其优越性及安全性的依据。
2.须说明可能出现的副作用或危害，并提出如何避免和减少其危害性或副作用的措施。
3.利弊的权衡。根据该治疗方案可能达到的疗效及可能出现的风险，提出总体的利弊权衡的估价。这种估价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。
（三）制剂的制备工艺简介：
二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控
（一）治疗用的目的基因及其质粒的组建：
不论何种导入形式，首先应说明基因治疗所用的目的基因及其来源（尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料）、分离的材料方法、克隆步骤、DNA序列分析结果以及重组体质粒组建详细步骤及鉴定结果。
（二）基因导入系统的组建：
这是指将目的基因导入细胞的系统，包括病毒型与非病毒型系统。病毒型导入系统包括逆转录病毒载体、腺病毒载体物质、腺相关病毒载体等。非病毒型导入系统除裸DNA外，一般包括两个部分：一是哺乳动物细胞表达载体；二是其它载体物质，如脂质体、多肽或金属粒子等。为此，需说明目的基因导入系统的性质与内容。
1.病毒型基因导入系统：
（1）病毒载体及目的基因重组载体
a.载体的来源、结构及专利查询资料
包括载体DNA的限制性内切酶图谱。若有特殊的元件，如启动子、增强子及PolyA位点等，应提供详细资料。若有改变结构（如丢失片段或插入片段），须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体，须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。
b.目的基因的重组载体：
须包括目的基因的来源、分离方法及步骤以及DNA测序结果，并须说明目的基因的重组载体的组建方法、包括插入的步骤、限制性内切酶图谱。
c.目的基因的稳定性：包括目的基因的重组体结构与表达水平的稳定性资料。
（2）包装细胞及产病毒的种子细胞库的建立：
a.包装细胞：来源、传代历史以及质控的材料。包括细胞形态学、染色体组型、支原体、细菌、病毒等外源因子的检测结果。若需用其它辅助病毒，须说明其来源、分离的方法步骤。
b.产病毒的种子细胞库的组建：
由病毒载体转染包装细胞所组建的能复制并产生病毒的细胞系称为产病毒细胞系，即种子细胞库。该种子细胞库的组建过程必须予以详细说明，包括材料、方法、步骤、细胞系的鉴定。申报材料包括：
●细胞形态学
●染色体组型
●传代次数
●病毒滴度的检测，包括检测技术及可靠性的依据
●病毒介导目的基因的表达活性
●外源因子检测结果
●复制型病毒的检测，包括方法、技术可靠性及结果
（3）工作细胞库的建立及质控：
须说明工作细胞扩增的方法、传代次数、倍增时间、可允许的传代次数（保持同样的病毒滴度及转导基因的活性）及工作细胞库的规模、保存条件并提供以下资料：
●细胞的均一性：包括细胞形态学、染色体组型、表型、导入基因的存在状态及其表达。
●病毒滴度
●转导基因的活性
●外源因子检测结果
●复制型病毒的检测
所有以上的项目在自检的基础上，均须由中国药品生物制品检定所检测或由国家药品监督管理局指定的单位检定。
2.非病毒型基因导入系统
非病毒型基因导入系统，均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外，还须附加其它的组分进行加工，如脂质体、多肽系统、金属颗粒等。申报的资料须包括：
（1）目的基因的表达载体：
提供表达载体的来源、专利查询资料。说明载体组建的方法、步骤、限制性内切酶图谱、质粒的元件构成（包括启动子、增强子、polyA位点等）。耐药基因若属耐氨苄青霉素基因，必须说明使用该基因的原因及以后采取确保安全性的措施。
（2）目的基因表达载体工程菌的种子细胞库、工作细胞库的建立，包括上述重组载体转化所用菌种的来源、基因型及表型。种子细胞库的传代次数、质粒拷贝数及基因表达量等。工作细胞库的组建包括扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数、细菌的同一性、外源因子（如杂菌、真菌、噬菌体等）的检测等。
（3）DNA制备与纯化的工艺。
（4）DNA纯度（超螺旋型的含量），细菌基因组DNA、RNA、蛋白残留量及热原质检测结果。
（5）若用物理方法导入，须提供其详细方法、步骤，基因导入效率及其表达活性以及导入细胞后基因的稳定性，无重排或突变的证据。
（三）治疗用制剂的制备工艺及质控：
基因治疗制剂包括直接把病毒或非病毒型基因导入系统作为制剂和通过病毒或非病毒型导入系统，把目的基因导入细胞（同体或异体），而以细胞为最终制剂。对制备工艺及质控必须提供标准操作流程，并按其步骤严格实施。
1.病毒型导入系统作为最终制剂：
这包括应用逆转录病毒、腺病毒或其它病毒作为目的基因的导入系统，直接用于人体的方案，须提供以下资料：
（1）产病毒细胞扩增的步骤，病毒的分离、富集及纯化为制品的全部流程。
（2）最终制剂的质控应包括：
a.病毒滴度及最终制剂所含病毒量
b.病毒介导基因的活性
c.复制型病毒的检测
d.内毒素检测
e.无菌试验
f.过敏试验
g.异常毒性试验
（3）属逆转录病毒的导入系统，应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5％。细胞须用共培养法，产病毒细胞取样量须达每批中1％。检测方法，须用S+/L-法、标记挽救法或RT／PCR中的两种方法。必须用阳性对照（COS4070A上清液）及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。
a.腺病毒颗粒数及感染单位的测定：目前公认的腺病毒的定量，是腺病毒颗粒测定，以腺病毒基因组DNA定量为依据，以1个OD260单位作为1.1×1012颗粒；同时要测定感染滴度。
参考美国FDA1996的建议，在一个病人用的腺病毒的总量中，复制病毒不超过1个PFU。在整个制备过程中，从种子细胞库、工作细胞库的建立以及以后制备用于临床的病毒制剂，均需检测复制性腺病毒。检测必须有阳性对照，感染分子比率（MOI）在10～100之间（过高MOI可抑制复制性病毒的生长）。
2.非病毒型导入系统作为最终制剂：
这包括表达质粒DNA的直接导入或制备成脂质体、多肽／DNA复合物或金属粒子通过基因枪导入人体等。凡属此类者须提供以下资料：
（1）制备工艺流程应包括几个部分：
a.目的基因表达质粒DNA的制备工艺：包括大量扩增、DNA分离、纯化成半成品。
b.脂质体多肽或其它介导物质的制备工艺。
c.加工为最终制剂（如脂质体、多肽／DNA复合物或其它）的制备工艺。
（2）DNA半成品的质控：须包括DNA的纯度、超螺旋体的比例；细菌RNA、基因组DNA及蛋白残留量。DNA制备不得应用氯化铯类化合物。
（3）脂质体、多肽类的质控。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。
（4）最终制剂的质控：
①须提供最终制剂的均一性的资料，不同批号存在的最大均一性的程度，并通过有效性与安全性试验证明在该均一性的范围内有效与安全的证据。
②提供以下检测资料：
●无菌试验
●过敏试验
●异常毒性试验
●介导目的基因的活性检测
●有害物质残余量的测定
3.以基因工程化的细胞为最终制剂：
这是指应用病毒型或非病毒型基因导入系统，将目的基因导入细胞（自体或非自体细胞），然后扩增成制品而用于病人。这包括exvivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗申报临床试验指导原则》进行申报，同时须提供以下资料：
（1）细胞扩增的全部制备工艺，包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、洗涤最终制品中所用的保存液配方。
a.细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。
b.活细胞比例。
c.目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因\插入性突变\及其观察方法及结果。
d.上清液中的细菌、热原质及其它外源因子等。
e.上清液中小牛血清蛋白残留量。
f.若为释放病毒的细胞，须补充提供：
①病毒滴度。
②病毒转导基因的活性。
③复制型病毒的检测。
（3）最终制剂（分装后）的质控：
a.冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。
b.冻融后细胞上清液（抽样、三批）中的下列检测结果：
①无菌试验。
c.冻融后细胞的异常毒性试验。
d.若属产病毒细胞，需补充：
②病毒转导基因活性。
e.支原体检查。
鉴于某些细胞产品，有效期较短，而有些项目的检查须较长的时间（如支原体），这些试验项目可对每批最终产品作留样检查，而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果，应及时对生产过程作检查，对已发放的产品立即采取措施停止使用。
（4）附加物的质控：附加物指细胞培养、制备过程中所用血清、生长因子、抗菌素等。对小牛血清蛋白残留量必须检测。对其它因子须说明去除的过程及效果。若加入细胞因子，应单独作出说明。所有保存液成分应提供其安全性的依据。
（四）连续三批基因治疗制剂的原始制造及检定记录
（五）中国药品生物制品检定所的检定报告
（六）基因治疗制剂的稳定性试验资料：需提供保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察的具体数据
三、基因治疗的有效性试验
在临床试验前，须提供基因治疗申请方案的体外及体内试验有效性的资料。
（一）体外试验：
须证明该外源基因导入细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。
（二）体内试验：
提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径（如动脉插管）有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。
若有些方案在动物中难以观察其疗效（如种族差异），应充分提供有效性的间接或旁证资料或依据。
四、基因治疗的安全性试验：
对质控合格的基因治疗制剂，须提供以下安全性试验的资料：
（一）总体安全性评估：
除了在质控中已规定的各项要求外，对于exvivo用基因工程化的自体或异体细胞导人体，应提供以下资料：
1.生长因子的依赖性细胞，对其生长行为必须予以监检。若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖性，不能再予以使用。
2.对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
3.对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全性的依据。
4.致瘤性试验：
无论是自体或异体细胞，经基因操作后，均须作致瘤试验。对于瘤苗类制品，必须提供该瘤细胞经过何种处理能有效地阻止继续增殖的证据。致瘤性试验包括软琼脂细胞生长及裸鼠内致瘤试验。
5.细胞种类均一性的监控。对瘤苗类制品，应提供如何去除非肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性的依据。若从肿瘤组织中分离非肿瘤细胞（如淋巴细胞），则必须提供消除肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性（包括致瘤试验在内）的依据。
6.复制型病毒的检测，若应用病毒型导入系统必须严格检查复制型病毒［见二（三）1（3）］。
7.特种添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，某些exvivo或invivo导入基因或细胞时，加用的明胶、缝线或金属粒子等其它添加物，对此类物质必须有动物实验证明其体内的安全性。
（二）分子遗传学的评估：
对invivo的治疗方案，必须提供动物体内目的基因导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的存在状态及表达情况。对于exvivo的方案。须提供导入基因的细胞进入体内后，基因的表达情况。
（三）毒性反应的评估：
这是安全性试验的重要组成部分。invivo的方案必须提供毒性反应的详细资料。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性（最大耐受量）及长期毒性试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量（按体
重或表面积计算）外，尚需有一个较大的剂量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外。应包括与基因治疗相关的检测指标。
对于exvivo方案，对瘤苗类或淋巴细胞、巨噬细胞类等自体细胞的导入，一般可免做动物急性和长期毒性试验。但若加入特殊的添加物（如明胶、缝线、特殊的导管等），以及对于某些重要人体脏器内导入（如心、脑、肝等），必须作动物体内毒性作用的试验，并提供详细资料。若exvivo方案添加细胞因子，亦必须提供其安全性的资料。对采用皮肤、皮下、肌肉给药途径的方案，无论是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的资料。
（四）免疫学的评估：
无论病毒型与非病毒型载体系统，均需注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应（如对裸DNA）等。为此申报材料必须尽可能提供这方面的有关资料，并对可能发生的免疫反应提出相应的监控及处理措施。
对用于改变机体免疫状态的目的基因及其导入系统（如瘤苗、导入细胞因子基因或输入基因工程化的免疫细胞），更需提供它所引起的机体免疫改变以及可能的副作用的资料（参照人体细胞治疗申报临床试验指导原则）。
（五）致瘤性试验：［见（一）4.］
五、基因治疗临床试验方案
基因治疗不同于一般生物技术制品的临床应用，首先是它的复杂性。需有经验的临床单位和专家将制品输入或埋入人体的特定组织，甚至通过手术进行操作；二是它的风险性，尚存在许多未知的因素，须对临床研究的全过程进行严密监控。为此必须有临床与研制单位联合申请。临床研究方案除参照国家《新药临床研究的指导原则》外，必须包括以下几点：
（一）单位主管部门〔相当于省(市)卫生厅(局)〕审查意见，包括对\方案\的必要性、可行性、安全性及对参加研究的临床和基础研究单位、人员的资格审查意见。
（二）提供基础研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员（包括负责医师、护士和实验室操作人员）的工作简历及从事与\实施方案\有关的经验。提供研究单位符合GMP生产条件的证明以及临床单位具有实施临床\方案\的医疗条件。
（三）应制定病例入选、排除与淘汰的标准，包括病种、病人的年龄范围和性别、疾病的发展阶段（临床分期）等，以及试验的病例数。
（四）给药的方式、剂量、时间及疗程。如需通过特殊的手术导入治疗制剂，须提供详细的操作过程。
（五）评估疗效的客观标准，包括临床指标和实验室检测项目。
（六）评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准。以及监测毒副作用所必需的临床与实验室检测的项目。
（七）提供基因导入后是否导入非靶组织的分子生物学检测的项目、方法及指标。
（八）若导入病毒或可能改变机体免疫状态的制剂，须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。
（九）对可能产生的副作用或不良反应的记录及总结的表格。
（十）建立实施治疗方案中的事故报告制度。
（十一）随访的计划及实施办法，包括须检测的项目。
（十二）在临床研究过程中，必须严格防止环境污染的措施，如应用病毒，必须防止及证明不发生水平感染的可能性，以及防止对儿童及孕妇的影响。
六、伦理学考虑
申报材料中，必须提出实施方案中有关伦理学方面的材料。必须充分重视伦理学的原则并具体按国家药品监督管理局GCP规定的要求严格实施。包括在实施本方案前，须向病人说明该治疗方案属试验阶段，它可能的有效性及可能发生的风险，同时保证病人有权选择该方案治疗或中止该方案治疗，以及保证一旦中止治疗能得到其它治疗的权利。严格保护病人的隐私。在病人家属充分理解并签字后才能开始治疗。基因治疗目前不用于生殖细胞。
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