小丫 发表于 2014-3-12 22:34:30

从互作揭开lncRNA的秘密

西方有这样一句老话,通过一个人的朋友就可以判断他的为人,这句话同样适用于生物分子。如果你想知道某个生物分子的功能,可以从与它相互作用的分子入手。近年来,长非编码RNA(lncRNA)得到了研究界的广泛关注。如今,人们已经鉴定了大量lncRNA,但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题,研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究,并为此开发出了越来越多的分析工具。RIPRNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP(RNA immunoprecipitation),可以说是RNA版的ChIP(染色质免疫沉淀),该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。在RIP试剂盒(如Sigma的Imprint? RNA Immunoprecipitation kit)的帮助下,研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体,从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA,再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。不论是细胞质还是细胞核,都会发生RNA与蛋白的相互作用。据Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp介绍,该公司的RNA ChIP-IT? kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作,随后对染色质进行超声,并用DNAse I处理,最后利用磁珠进行沉淀。“如你研究的是总mRNA,那么常规RIP试剂盒更合适一些,”Hondorp说,“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”生产Magna RIP? RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司,也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布,该产品有化学交联与native两种形式。据介绍,化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用,研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是,亲和力更高也更为直接的相互作用。除RIP以外,CLIP(UV crosslinking and immunoprecipitation)也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化,不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化(如凝胶电泳片段分离),还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术——iCLIP(individual-nucleotide resolution CLIP),该技术能够以单个碱基的分辨率,来展示RNA-蛋白互作的详细信息。据伦敦大学学院的Jernej Ule教授介绍,CLIP与RIP的关键性差异,在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记,并将这些复合物进行SDS-PAGE分离,之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性,减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来,用于制备cDNA文库,以备测序分析。“CLIP要比RIP麻烦一些,不过我认为它很值得采用,”Ule说。“放射性信号的量及其特异性,能够帮助我们提高cDNA文库的质量,最终得到准确实用的数据。”ChIRP、CHART和RAP如果你对某种RNA感兴趣,希望研究与其发生相互作用的蛋白,就需要采用新的实验方案。ChIRP(chromatin isolation by RNA purification)、CHART(capture hybridization analysis of RNA targets)和RAP(RNA antisense purification)都基于同样的理念,将与目标RNA互补的寡核苷酸进行生物素标记,并由此捕获相关蛋白。之后研究者可以通过二代测序或质谱分析,来鉴定与RNA互作的蛋白,明确发生这些互作的基因组区域。据NEB的G. Brett Robb介绍,上述三种方法解决了当今RNA生物学中的关键需求。目前,研究者们已经鉴定了大量的lncRNA,但却不清楚它们的功能。“解决这一问题的途径之一,就是寻找与这些RNA发生互作的蛋白。”举例来说,加州理工学院的Mitchell Guttman和宾州大学的Jeannie Lee,就分别在使用RAP和CHART对Xist lncRNA展开研究。据悉,目前ChIRP、CHART和RAP技术都还没有商业化。不过有一个试剂盒可以实现从已知RNA分离蛋白,即MBL International的RiboTrap系统,该系统能够利用体外转录的RNA(带生物素标记),从细胞提取物中分离与之结合的蛋白。

小丫 发表于 2014-3-12 22:40:38

近年来,长非编码RNA(lncRNA)得到了研究界的广泛关注。如今,人们已经鉴定了大量lncRNA,但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题,研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究,并为此开发出了越来越多的分析工具。

让互作变的清晰可见

在体外确定了自己感兴趣的RNA-蛋白互作之后,我们可以通过体内实验进行验证。这时,Sigma公司的DuoLink? proximity-ligation assay就派上了用场。

Sigma公司的Aaron Sin介绍道,DuoLink系列原本用于研究蛋白质之间的相互作用。这一系统包括两种标记了寡核苷酸的抗体,这些抗体分别针对发生互作的两个目标蛋白。如果这两个抗体相距50nm以内,即表示两个目标蛋白发生了相互作用。在这种情况下,抗体上标记的寡核苷酸就能够相互作用。在滚环扩增之后,人们可以通过荧光探针杂交,检测到上述事件,在原位观察到明亮的荧光点。

最近,Georgia理工学院和Emory大学的研究人员将这一方法加以改进,使其能够用于蛋白与RNA互作的检测。该研究团队开发的这一新技术称为FMTRIPs(Cy3B-labelled flag-tagged, multiply labeled tetravalent RNA imaging probes),这种探针包括一个带多肽标签的亲和素分子,其上结合有四个荧光标记的序列特异性寡核苷酸探针。在RNA与蛋白结合的地方,上述探针能够产生明亮且可定量的荧光信号。

据Sin介绍,DuoLink技术能够帮助研究者们确定互作发生的位置,以及互作发生的条件,并且还能检验互作对干扰因素的敏感程度。

“你可以通过RIP鉴定与蛋白发生互作的RNA,然后用DuoLink分析互作事件的发生,或者观察药物添加对互作造成的影响。”

生物信息学途径

生物信息学技术也可以用于预测RNA与蛋白的相互作用。例如,catRAPID算法可以通过蛋白和RNA的序列,来计算可能存在的互作组合。

该算法的开发者之一Gian Gaetano Tartaglia解释道,这种算法对互作事件的预测,完全依赖于蛋白和RNA的序列信息,包括这两种分子的二级结构,氢键和范德华力。

用蛋白序列或RNA序列都可以进行catRAPID查询。该软件可以测试不同互作的相对强度,还能够将长序列打断以便于分析。新“omics”版的catRAPID能够在几分钟内,将输入序列与整个转录组(或蛋白质组)进行比对分析。

“三年前,计算一个相互作用需要三十分钟,”Tartaglia说。“而现在我们可以在十分钟以内分析处理整个转录组。”

目前,Tartaglia团队正使用catRAPID,在帕金森症、ALS等神经退行性疾病中,研究RNA与蛋白的相互作用,因为RNA结合蛋白在这类疾病中起了很大作用。
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