显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同,可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光(紫外线显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。 1 W3 x+ ~7 U' ], I$ Y
—、光学显微镜
# b+ h @5 _& o0 W, h& U (一)、普通光学显微镜
* n! O3 [2 c( g) ?: l* K; a% d 普通生物显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体,为了消除球差和色差,目镜和物镜都由复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定材料和观察方便(图2-1)。
* q8 k& @9 M, h" E8 O$ x![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163008206.jpg)
3 t! i" U& `8 ^' d# M; ]图2-1 尼康E-600显微镜
4 @2 Z4 d3 I" p6 ]( t 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率,用公式表示为:
8 e0 ?' Z$ ], R9 ~ R=0.61λ /N.A. N.A.=nsinα/2 5 P5 l1 Y. b: P
式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。 / S+ H/ w1 g4 C/ G- S" c' I$ u
表2-1 及中介质的折射率
4 v, h% u, q( F0 r
4 r' z1 O' }2 Y) q
8 q( W8 N& {% s" }4 b
7 j- f4 N' F3 a( p8 J1 u3 ]' r, X3 {% f# y
+ h! ?& T; `. p3 e
介质 | 4 {& j7 c& d3 \8 F2 e8 ~! [6 v. J! H
5 g' C: R& T% A! G- z7 N
空气 |
7 M3 W) x% _$ X& J' ^" j4 s" g! Y$ w+ w e, A& l. x: }
水 | 2 e! l2 [1 t' \
$ S, s! W8 _4 }" |6 I1 v" ` 香柏油 |
k0 S2 h, N" M7 V7 Q; s
L6 B2 O9 y# R. A3 e8 F5 e7 j α溴萘 | e; ]7 _) f7 h, O7 E1 z
; s4 {& K2 m: E0 ~' f
* K7 o' S0 o2 e* F 折射率 |
+ B7 |6 _8 b2 V8 C7 I& E( g& I/ h+ d8 a9 u- r g6 @
1 | ( [% X) N, |1 p1 w- c
0 E; [) r: k9 A: Q/ b5 U& i 1.33 |
& t9 \+ L5 x, R- }7 o4 Y0 [+ Z* Q; U* d; @
1.515 |
7 K* m) w1 O6 `8 u* ?1 d
9 f7 {8 E9 i: r) c5 C. z 1.66 |
. `- y5 C9 h5 H4 F$ P+ k, @ 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。
' x4 X" b G* [. Y0 r: [ 普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
5 w' J% h5 y ` (二)、荧光显微镜
( t$ y& W( h- ?, f) Z7 N![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163049676.jpg)
. Q& e8 t/ G; O# S7 T! ~& d图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜 2 H4 l9 m1 C u' O. }
细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 8 R _) _% a0 ~. c
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163049978.jpg) + a- T; X& ?6 m
图2-3 落射式照明原理
8 F( ^" w7 |% H8 n# J( G 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别: + I" |4 ]( l( {2 `: X9 y" S5 U, E
1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3); $ K+ r; b6 d( y
2.光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜; 0 A4 M U7 |" c- C4 p' `
3.有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人目。
' W5 x% p0 |3 c- X' F/ F8 b![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163049548.jpg) / f9 G7 O7 q! I, k0 i4 O
图2-4 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自http://www.itg.uiuc.edu 4 W: h S6 p! @; r5 @/ Z6 R# \
(三)、激光共聚焦扫描显微境 / t: K% d R, [0 `/ T% w5 G) \. L I
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051349.jpg)
( `4 L. `6 V- K, T$ i图2-5 激光共聚焦扫描显微镜
+ P# o9 ~4 w- d0 o![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051808.jpg) / D h! Y/ k0 f& J
图2-6 LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自http://www.itg.uiuc.edu , T# P1 ?2 k8 D0 Z2 P$ c
激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。 # S1 H. g) b" I4 U8 [
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。
" C; J0 j5 r' x9 H7 W# X (四)、暗视野显微镜
7 Y; |! G6 t( w o2 u# k8 p 暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。 6 d2 U* {: j4 c: D
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051309.jpg)
2 X* \' R) a9 s o# `图2-7 暗视野照明方式 8 B. V5 B; D9 |5 h
(五)、相差显微镜
' z) C8 F" F% T i; y$ P 相差显微镜(phasecontrast microscope,图2-8、9)由P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 2 S6 Q' z0 B( F5 Q. Y5 F7 O
相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: 1 _& ~" w) _! I
1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 / O) h6 b8 }2 J5 y
2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:
8 Z: ]% Z1 O& z# Z; g B 1.A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。
9 i+ \+ c2 F, O6 k 2.B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。
4 Q" d/ l! q/ u3 L![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051491.jpg) ; H; V1 E6 _- B1 R* M P6 P, G8 T
图2-8 相差显微镜照明原理 / d- `! u3 e( V( j: Y: w1 y
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163052379.jpg)
* S# ] u3 u& Z) o- o! |+ s图2-9 一种介壳虫的染色体(PCM照片)
$ S/ w- Z2 [3 K$ b (六)、偏光显微镜
8 |% B8 N [: e4 P 偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。
3 s& ?9 y6 D7 O5 K, M/ t (七)、微分干涉差显微镜
* R" s$ e8 Y2 U' t: o 1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。 5 m- m$ n" a9 f; D3 U' A9 k M7 z( ~* K8 {/ _
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图2-10)。
5 S2 U( ~9 g" ~6 T![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163052814.jpg)
3 s9 z/ O3 d$ ?% H图2-10 DIC显微镜下的硅藻(伪彩色) ' k/ Z# O* x* R3 v3 J- p8 S& p9 r# ?
DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 - e2 I* u# y! F: u
(八)、倒置显微镜 . W+ q+ n2 i! n7 {* ~! W* V
组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。
- y# `: `/ z3 d* X& V. I w& @2 p A$ ?![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163052313.jpg) , y5 m5 {7 V, V0 Y( c) B
图2-11 莱卡倒置显微镜
5 Z8 |1 G# _: M8 y1 G 进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体,从而操作灵活,使用方便。 ; ~& `/ u: L! b
[此贴子已经被作者于2005-7-4 16:32:31编辑过] |