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microRNA的发现(Discovery)7 B+ k+ }4 _% K( t( l3 m5 ^6 H
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1993年,Lee,Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA(lin-4),是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本,每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。对于出现这种现象的原因,科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3'UTR区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。7年后科学家又发现了第二个miRNA-let-7,let-7相似于lin-4,同样可以调节线虫的发育进程。
4 P4 n$ ?0 V# r 自从let-7发现以来,应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式,又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了成千的miRNAs。被鉴定的miRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。此网站由著名的Sanger研究所主办,并对公众开放。(http://microrna.sanger.ac.uk/)! F/ a/ Z+ s2 y( r
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microRNA的生物起源(Biogenesis) V+ P' w6 O! Z# r1 q* V# E+ j
miRNAs起源于内源性表达转录本,是长约21-25nt的双链RNA分子,其典型特征是具有发卡结构。图1表述了对当前miRNA和siRNA起源的理解。miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA(PrimarymiRNA)转录本(step 1);这个70-100nt的发卡RNAs(pri-miRNA)在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA(Precursor miRNA,)(step 2);之后pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质(step 3),接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21-25nt的miRNA(step 4);这个阶段的miRNA可以结合RISC(RNA-Induced Silencing Complex)并与靶标mRNA互补并列(step5-6);miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA要不在翻译水平被部分抑制,要不完全断裂(step 7)。植物体中,断裂似乎是主要的工作方式,而哺乳动物中则以翻译水平的抑制为主要方式。
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% [7 E, T' e. I) LFigure. siRNA and miRNA pathways in mammalian cells. Numerical arrows designate miRNA pathway, while alphabetical arrows specify siRNA pathway. 1) miRNA gene is transcribed into a primary miRNA transcript (pri-miRNA) 2) Pri-miRNA is cleaved by Rocha to a hairpin pre-miRNAs 3) Pre-miRNA is transported out of the nucleus by exportin-5 4) Pre-miRNA is cleaved by Dicer to form a short double-stranded miRNA duplex 5) miRNA duplex separates into single-stranded mature miRNAs and complexes with a RISC-like structure 6) mRNA binds with miRNA/RISC complex 7) mRNA is translationally repressed. A) dsRNA enters cell B) dsRNA is cleaved by Dicer to form a short double-stranded siRNA duplex C) siRNA duplex separates into single-stranded siRNAs and complexes with a RISC-like structure D) mRNA binds with siRNA/RISC complex E) mRNA is degraded.9 ?. `5 \' k r
! j- b& f$ R# j# E" n: p2 c siRNA途径是由导入外源的双链RNA(dsRNA)所触发的一种进化上保守的反应(step A);这种双链的dsRNA被核糖核酸酶Dicer消化为大约21-23nt的siRNA(small interfering RNAs)(step B);siRNA又与RISC相互作用导致siRNA双链的解离并与靶标mRNA互补并列(step C-D);siRNA与它的靶标mRNA有近乎完美的互补,从而导致mRNA在这些互补位点直接断裂(step E);科学家们就是人为的设计这种dsRNA或者siRNA达到对靶基因的降解。这些合成的沉默试剂作为一种新的生物学工具,极大的促进了新基因鉴定、基因功能分析和信号通路的研究。
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( r% v" g, Q/ Q7 Y9 ` BmicroRNA的研究领域(Research Areas), [* I( i8 Q4 @0 O; m$ w0 `$ I# o
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(1)miRNA表达谱(miRNA Profiling)" I' [% c' a# T1 V& w( S
由于miRNAs在众多程序的调控,诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用,因此miRNAs的鉴定和定性研究成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定miRNAs的方法是检测miRNA的表达谱,如果发现某一种miRNA在某种特定组织或细胞中特异性表达的话,此miRNA将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。同样,如果某一种miRNA在生物特殊发育阶段表达的话,则它有可能是调控发育进程一个主要分子。miRNA的表达谱可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的miRNA并测序完成,或者通过芯片检测得以完成。克隆和测序miRNAs是目前最常用的一种方法,虽然相当费时费力,但却可以发现新的miRNAs;而芯片检测虽然是一种高通量的检测方法,但只能检测已知的miRNAs表达水平。
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(2)miRNA功能分析(miRNA Functional Analysis)
8 v) d0 h* T0 G% l" G 随着成百上千的microRNA在植物、动物和病毒中被鉴定出来后,通过抑制细胞中miRNA的表达水平来研究miRNA的功能迅速发展为一个重要的研究领域。在此期间,miRANs在生理状态下的靶标须待鉴定,因此在探索miRNA功能的过程中运用人工合成的miRNA抑制剂成为一种重要的研究工具。miRNA的活性可以通过对与内源性miRNAs互补的磷酰二胺吗啉代反义寡核苷酸(morpholino phosphorodiamidate antisenseoligonucleotides )的化学修饰阻断。另外,锁核苷酸(locked-nucleic acid, LNA)具有更高的结合亲和力,通常被用来抑制人体细胞的miRNA。LNA修饰的探针也用来检测miRNAs的定位和表达方式。3 |) i. V( P* F" }) @4 s P
Dharmacon产品研发团队在探索miRNA功能的过程中运用人工合成的miRNA模拟物和阻遏物已经成为一种重要的研究工具;miRNA模拟物和阻遏物由于可以增强或者抑制内源性成熟miRNA的效应,成为研究miRNA功能的一个强有力工具。 |
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