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标题: Qubit荧光计 PK 分光光度计，核酸定量哪家强 [打印本页]
作者: 小丫    时间: 2015-3-12 21:21
标题: Qubit荧光计 PK 分光光度计，核酸定量哪家强
在新一代测序（NGS）实验中，我们需要将精确量的DNA文库分子上样到测序仪中。如果测序运行时的文库分子过多或过少，都会使数据质量受损。这不仅浪费宝贵的样本和试剂，也浪费我们和仪器的时间。对于芯片分析（Microarray）和实时定量PCR（qPCR）而言，精确测定样本中的DNA或RNA也是必需的。那么问题来了，核酸定量技术哪家强？
# q6 `+ I5 C3 W! n$ [# n以往，我们大多采用分光光度计来测定260 nm处的吸光度，对DNA和RNA进行定量。尽管这种方法被广泛采用，但并不意味着它的读数是准确而可靠的。紫外吸光度测量不具有选择性，无法区分DNA、RNA或蛋白质。而一些游离核苷酸或多余的盐离子也会影响检测的数值。此外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。
- I" H0 @7 }6 }. z; B% ?7 y其实，我们还有另一种方法可以选择，那就是荧光染料法。Life Technologies（赛默飞世尔旗下）的Qubit? 3.0荧光定量仪正是基于此原理工作的。它采用荧光染料与特异的靶分子结合。只有当荧光染料与样本中的特异分子（DNA或RNA或蛋白质）结合时，才会发出荧光信号，从而大大提升了研究的准确性。

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图1. Qubit? 3.0荧光定量仪

* X8 z( X' I" }6 X/ r: DDNA或RNA的选择性PK
8 f. U. e2 w7 L  C/ d7 Z- ^研究人员曾经做过实验，使用DNA和RNA含量相同的样本，利用Qubit? dsDNA BR 分析试剂盒测定其中DNA的浓度，结果发现测量结果在实际含量的的±2%范围内，足以证明Qubit?的厉害。之后，他们使用了RNA含量比DNA高10倍的样本，发现测得的DNA浓度仅比实际值高7%。再来看看分光光度计的表现吧。研究人员发现它们无法准确测定上述样本中DNA和RNA的含量（图2）。好吧，第一回合Qubit? 获胜。
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图2. 采用Qubit? dsDNA BR和Qubit? RNA BR分析试剂盒及Qubit?荧光计，按照试剂盒实验方案检测含有lambda DNA (10 ng/μL)和不同量的大肠杆菌核糖体RNA (0-100 ng/μL)的样本，每个样品重复3次。然后采用NanoDrop? ND-1000分光光度计检测同一样本三次，采用PerkinElmer? Lambda 35分光光度计检测一次。标示的浓度是在Qubit?分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA浓度。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA和RNA的实际含量。: s: ?( c' U; P* ~1 X( i
低浓度下的准确性PK/ b$ C3 P: B) P8 X; ~
研究人员之后采用Qubit? dsDNA HS分析试剂盒及Qubit? 荧光计，定量浓度仅为10 pg/μL的样本中的DNA，发现测得值在实际值的±12%范围内。而采用分光光度计测量上述相同样本，测得的浓度比实际值高46倍。而对于10 ng/μL的样本，Qubit? 测得值在实际值的±1%范围内，而分光光度计测定的浓度在实际值的±5%范围内（图3）。显然，在样本浓度低的情况下，使用Qubit? 更为合适。
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图3. Qubit? 荧光定量的准确度和精度。根据标准试剂盒实验方案，在Qubit? 荧光计中采用Qubit? dsDNA HS分析试剂盒重复10次测量浓度在0.01至10 ng/μL之间的lambda DNA。同时采用NanoDrop? ND-1000分光光度计重复10次测量相同浓度的DNA，比较结果的准确度(A) 和精度(B)。
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样本浓度范围PK
8 y$ g& A) _* _( m$ A0 t) P# ?  GQubit? 的配套试剂盒有很多种，分别适合dsDNA、ssDNA、RNA、microRNA和蛋白质。其中，双链DNA分析试剂盒又分为高灵敏度（HS）和宽范围（BR）两种，适合10 pg/μL至1 μg/μL的DNA。与之类似，Qubit? RNA HS和BR分析试剂盒覆盖的样本浓度范围在250 pg/μL至1 μg/μL。而分光光度计的检测范围通常在2 ng//μL至15 μg/μL（图4）。由此可见，Qubit? 适合的浓度范围更宽，不过，高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。

( u: t( j* s/ a. M- @8 f, Q图4. Qubit?分析与采用NanoDrop?分光光度计进行紫外吸光度检测的样本浓度范围比较。* d1 e* @9 C, }: T4 [
其他方面PK
. x4 W" D; {2 _& e& j4 q( B% T当然，分光光度计也有它的优势。全光谱吸光度读数可以通过吸收峰显示是否有污染物存在。另外，它的使用成本较低，上样、测定、擦拭即可，几乎不需要消耗品。而Qubit? 则需要购买配套的分析试剂盒。
8 k7 p2 l: q0 C% ]8 r. g想必大家还对第一代的Qubit? 荧光定量仪记忆犹新，活脱脱一个复活节的彩蛋嘛。如今，Qubit? 已经升级到3.0的版本，虽然没有之前那么萌，但易用程度再次升级。5.7英寸的彩色触摸屏方便设置和使用，更有多种操作语言供你灵活选择。全新的荧光计模式，使得您可以获得每个样本的原始荧光数据（RFU），配合MyQubit在线工具可以创建新的分析类型，不断扩展您的应用范围。Qubit? 3.0荧光定量仪采用强大的双核处理器，5秒内快速准确地定量DNA、RNA和蛋白。大尺寸的彩色触摸屏和Android系统，使得操作非常简单直观。浓度计算和设置都由仪器自动完成。若样本浓度处于延伸范围或超出范围，屏幕上均会有图形显示。
* G. V5 n7 r( h( a  \测量工作也很简单，所有Qubit? 试剂盒均采用相同的操作方案，只是孵育和读数稍有差异。其中DNA和RNA分析试剂盒仅需孵育2分钟，而蛋白分析试剂盒需要15分钟。1-20 μL样本均可使用。Qubit? 最多可储存1000个样本结果，您可以通过U盘导出，也可以使用USB连接线直接与电脑相连。
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& T' Y6 O# Q# G! |( D2 B如今，Life Technologies提供单台Qubit? 荧光定量仪、起始套装（包括四种分析试剂盒）以及NGS起始套装，供您选择。如果您还没有下定决心购买，可以先申请试用，看看它的表现如何。



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