显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同,可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光(紫外线显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。 2 d4 b" J3 ^0 j) ~6 P+ m
—、光学显微镜
2 `( a% ?2 p6 A: D+ N8 J, }1 ^& d (一)、普通光学显微镜 : i1 N2 i& ?# v7 t! V& W
普通生物显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体,为了消除球差和色差,目镜和物镜都由复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定材料和观察方便(图2-1)。 * I9 |% Q" K0 r, r+ q9 b
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163008206.jpg)
3 t5 F; Q) X: y+ e图2-1 尼康E-600显微镜 , G2 w6 z$ B+ Z/ s) o! X* e
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率,用公式表示为: 3 q2 L/ n1 V6 D" h2 k
R=0.61λ /N.A. N.A.=nsinα/2 ' C3 B" I& |0 d0 c# F
式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。
/ o: D/ y5 w' w2 f* j表2-1 及中介质的折射率
7 t3 B. I, C9 b
( c. i# ~3 J7 S, W# Q, ]. S% @ ; |. F4 X' d' l
+ d% W5 g) S. \% A/ }( z* M( w% {
' o1 E/ h& S6 L, [) j
! {$ N3 E* J: U7 N4 G9 _ ~7 W. t 介质 |
" ], o. l9 e4 W# D g/ M' A6 z: A* Q( M U7 K/ [* ?. G+ Z
空气 |
8 R- L3 @) H6 B4 X7 p: O! G( }7 T0 O3 g5 L* O) M: [% w' o
水 |
# |' V3 [" D. Y1 D5 J! B
" O& i2 Z3 T. _, \) n) e/ b. m 香柏油 |
6 `, l) \6 Z# f* _$ y8 M
- t# G3 g+ U) D! }2 P$ S7 c α溴萘 |
" C2 U2 Q6 O) S$ a" B% A3 ]& s \5 z3 z2 H- h) b
& `9 a' c7 W& D& z 折射率 | 9 F" ~/ `9 x8 S5 G
2 p. f4 O% {1 H x* M1 u
1 |
" x; F5 D0 F9 L: b D6 V7 M7 R7 P, j1 G$ H
1.33 | + M, N7 v6 Y9 x a
+ m+ w, R3 Q5 N* c5 q. j g 1.515 | 8 k7 }9 p. i" g
$ v$ L1 L: n! i, E6 Q 1.66 |
( X( [2 D0 P2 S9 x 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。 8 q/ J. |% D1 Z6 E
普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 . Q8 B+ v: }; A
(二)、荧光显微镜 " S! y* X& P! r/ @& H E
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163049676.jpg) . v& a, N, G* J7 a; d. T& K- s
图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜
6 p7 z7 o0 g" F7 e- c 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 4 a0 P9 ~( x* j/ u, T
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163049978.jpg) % C- O! F- Z9 ?; U7 U$ A0 b4 R$ A
图2-3 落射式照明原理
$ }* x4 x* A2 d* m: b 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别: 7 a6 [ \4 z: j& B2 v4 R2 D
1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3);
0 @& k y; @% y! [- T 2.光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜; ( q) Q; f! s9 b$ n* }- i/ P
3.有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人目。 . ~) S7 d _, t- N8 g. T3 u$ i
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163049548.jpg) & h5 f5 P0 r+ y. K
图2-4 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自http://www.itg.uiuc.edu 7 i- t3 J4 f8 A: Y2 |" B" G; C
(三)、激光共聚焦扫描显微境 9 T4 ^9 j6 X# W- F4 f- ~
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051349.jpg)
8 a- \. i& Z" S2 A图2-5 激光共聚焦扫描显微镜
; o+ E8 ~; v4 x' L4 K! M![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051808.jpg) 1 q: z n4 s0 I6 g- g" K3 B2 `* {
图2-6 LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自http://www.itg.uiuc.edu 7 E8 K3 m- E7 E0 R' q9 E- s8 K
激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
) X" `1 T- u- U2 z 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 # u. k5 r1 D. x' ]. Z" u, @
(四)、暗视野显微镜
3 k$ C$ S" m7 A1 h- U' D 暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。 * ?( d: G8 N( U8 ]! T. [
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051309.jpg) . L; H( s! u. N+ D6 p( v" G# _
图2-7 暗视野照明方式 ( H* v. c8 w3 d/ O
(五)、相差显微镜
; [2 ? ]" i5 S3 H1 Z 相差显微镜(phasecontrast microscope,图2-8、9)由P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
4 ~, d/ e$ h* o6 L6 G 相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: ( x- L0 m6 b, r
1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 9 P* P! A- j+ y/ v
2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种: 6 k" E/ v! g! g! x& g; X0 T
1.A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。 5 H# w, z0 A; K" B. A
2.B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。 1 `9 s# B( Q; w3 P7 t, @, V) v. j0 |* }
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163051491.jpg)
, |5 W! C& j* d E6 Y, [$ H" Z图2-8 相差显微镜照明原理
. J7 p: X$ `1 D9 n# J![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163052379.jpg)
6 e3 L: J7 Q6 W* O# {6 v图2-9 一种介壳虫的染色体(PCM照片)
) N; @/ w6 n; i J7 m. z (六)、偏光显微镜 ' v3 Z% I4 n$ H4 A& b# D8 H( N- z( a% s8 z
偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。
9 o6 y! W9 x5 p$ G" P$ v! b (七)、微分干涉差显微镜 % _3 m/ X1 k$ ^2 M9 t' I/ |4 I) N
1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。 - P4 Y# Z; k# {+ K2 r. p! \
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图2-10)。 % k1 H/ D4 N% b2 X; h% L* @ y
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163052814.jpg)
, \3 u6 c K: H& S- U图2-10 DIC显微镜下的硅藻(伪彩色) 2 o m6 N+ b: X7 `- c
DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。
$ F. `1 U- L2 [# h( X+ n$ q (八)、倒置显微镜
9 A. ?3 K3 M: P 组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。 - |" F8 S7 ~+ w7 Y: \9 U6 H6 d
![](http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/200406/20040603163052313.jpg)
2 C; J9 u4 `; b# M图2-11 莱卡倒置显微镜
6 U$ U# T6 d9 v 进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体,从而操作灵活,使用方便。
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