显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同,可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光(紫外线显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。
! B5 n+ U h; P% ?) A$ W1 g% {( Z7 B—、光学显微镜
2 m' D* x% b7 o; X, w
(一)、普通光学显微镜
* W1 x$ ~0 ^ ^' \5 G( d* E; K' ?2 x 普通生物显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体,为了消除球差和色差,目镜和物镜都由复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定材料和观察方便(图2-1)。 4 T/ y8 e1 G1 R
# j/ q a# g* P. Y% D) A) }& e图2-1 尼康E-600显微镜
$ ^- U F1 g# N- W& p! |8 V8 V/ u 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率,用公式表示为:
9 O5 d9 c0 q% | R=0.61λ /N.A. N.A.=nsinα/2
/ H n2 R' V2 M1 T8 {- D 式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。
+ `" L. x# G' `6 `( ]* Y表2-1 及中介质的折射率
2 S( x3 h. j% t
5 Y8 z! Q( z# r3 }$ _- |6 k - A S, F( b: e( i* e
, b5 T; y* S8 I. s) c
' Q8 q1 j, L% ?; j1 n
, x& O& R5 z9 \. M
介质 | " e* ~1 b; q Z8 D; ~4 R
1 A+ u \: D: Q/ B 空气 | 7 }2 w% A. k% v. H
2 z' l/ i% y. p 水 | ( Z* z7 @/ R6 s8 X9 ^
% A2 p. ]7 `4 I1 Y- n 香柏油 |
: g; O3 b5 J1 i2 c4 L) ^. x1 J L2 v- j+ W* {) h" Q8 y
α溴萘 |
3 e0 D0 q0 V3 p& S8 i, p+ q) ^9 a( w% B* }* _* x5 x& E% s0 v& w
7 \1 i4 z1 W5 ^( `4 q$ f! t8 a
折射率 |
8 `& j) A" I- m* a% V9 ?9 U
' I7 V: k7 _% v0 z F 1 |
6 s' z1 D c0 \: A! h& V
4 t& q3 a/ w* A: h( p 1.33 |
! N; Z: Y* a$ K. R* Z. C$ Q# L1 i# p- A, t8 Z! U
1.515 | % ?8 ~- V8 J0 \% n
' J1 Q! C x1 X" `6 ~! _, `" P 1.66 | * N( Y1 d& S6 q( S
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。 8 P* N, W/ \( {' d- X
普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
1 v0 p% ?+ s6 a2 _2 W8 V (二)、荧光显微镜
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: n% a8 M: g, W! h& z2 E; j* c图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜
* L4 C# {7 Q2 a- c0 L 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 5 u$ U5 c: C- e1 O6 T" E' E$ {
- s* V6 d: e" z. [8 `- `图2-3 落射式照明原理
" P3 T- h" ~" p4 s! |: I 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别:
& R) X; n8 r; x' {5 o/ j5 i" O% ^ 1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3);
& U i' I1 `8 j4 Z0 L 2.光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜; 7 r# e4 E$ ?( O: a! |( S) B2 V
3.有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人目。 ! N8 O4 _6 Q# l. s- O6 n7 `8 d
5 ~: A/ ~; ~' H6 g图2-4 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自http://www.itg.uiuc.edu - }; |0 L6 }5 U! w
(三)、激光共聚焦扫描显微境
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$ k+ z/ E- J+ G+ A图2-5 激光共聚焦扫描显微镜
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9 v* F/ N5 E |7 r8 v ~8 k# U图2-6 LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自http://www.itg.uiuc.edu h7 s* `( }* h g- w
激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
: q1 g9 _ m# f: w8 O% v 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。
$ `5 q. T( [. i (四)、暗视野显微镜 * ^- D9 c: J% C: o
暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。
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9 X5 s& @; D" e2 u" t& ?& i0 F. |图2-7 暗视野照明方式
: D6 D* a% N6 x+ t# b9 G (五)、相差显微镜
4 @0 m9 e8 g1 u! C) H4 w4 s 相差显微镜(phasecontrast microscope,图2-8、9)由P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
T5 J( \4 M7 H0 ~4 t 相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:
# R: X& |) c: q8 H9 @# R* q- e 1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
+ g5 P% D' ? e- h 2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:
\) K/ s6 n0 S, I, z 1.A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。 ! l) z6 \( q! [. u7 i
2.B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。 ) {5 z5 ]( `8 Q. y; @: Q/ |) H! Q
. T' Q* s$ \: c图2-8 相差显微镜照明原理
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图2-9 一种介壳虫的染色体(PCM照片)
: Y3 P( n, j) S5 { (六)、偏光显微镜 " p* V& P2 } T" Z+ [) ?$ _+ x! H
偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。 : h) |: ?+ X. N& S: X
(七)、微分干涉差显微镜
9 z% Y5 X& C9 K2 t+ Z8 d4 E 1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。
1 X7 z: r! p4 L: F* o, G DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图2-10)。 ' A( Z" J5 F s/ G$ b! b. L& E1 V
1 s M& Q' F: ?8 Y- ?& p图2-10 DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)
5 \% M2 h l# N: K DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 9 w" o( n- J& w, R
(八)、倒置显微镜
( S9 t+ E' U2 a/ l7 ^ 组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。 - q, K; {* \$ U9 i0 T% z
4 O5 q7 { Z0 _% G: Q" M0 i1 @图2-11 莱卡倒置显微镜
5 q) ?! {/ p" S. W) S8 q( s }$ e 进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体,从而操作灵活,使用方便。 $ P0 f4 z! s+ Q
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