试管婴儿/胚胎着床前遗传学诊断概况

子言听雨 · 发表于 2011-12-14 10:40:13

随着体外受精胚胎移植(IVF-ET)及胞浆内单精子注射(ICSI)的广泛应用,使得越来越多的不育症得到有效的治疗,但由于不育夫妇遗传异常的发生机率明显增加,IVF获得的早期胚胎遗传异常的发生率也明显增加[1,2],因此对遗传异常筛查的着床前遗传学诊断(preim-plantation genetic diagnosis,PGD)显得十分必要[3]。
   PGD可以诊断任何染色体或基因定位的疾病,是对IVF后4~8细胞期胚胎显微操作获得的1~2个分裂球进行的遗传学分析。研究表明:8细胞期胚胎的活检操作对着床前活检的胚胎发育非但无损,甚至可能有益于胚胎的孵化。PGD可以在数小时内完成检测,将确诊为正常的胚胎在当日便可移入子宫,无需进一步培养或冷冻保存。
   一、PGD的方法
   1.聚合酶链反应(PCR)技术:首次用于PGD是在1989年,通过PCR扩增了Y染色体位点特异序列,判定携带有X连锁隐性疾病双亲的子代胚胎性别[4]。随着该技术不断完善,出现了巢式PCR。引物延伸预扩增PCR。荧光PCR。荧光多重PCR等技术可以准确研究遗传基因,最适合于对单基因疾病进行研究[5-7]。
   2.荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH):是研究人类胚胎染色体异常的较好方法,它可以对染色体和DNA进行准确的研究,可以进行性判定。非整倍体核型普查和染色体结构异常分析[7-10]。FISH是采用荧光标记的DNA探针特异地结合到固定细胞的DNA上。通过使用不同的荧光标记探针,可以在单一的细胞中同时分析多个染色体,比传统的核型分析节省很多时间。此外,FISH可以对间期细胞核进行染色体计数,不需要象核型分析那样培养细胞或制备分裂中期细胞。由于单一细胞产生中期分裂细胞的机率较低(约20%),FISH是目前用于检测胚胎单一细胞染色体数目异常的唯一有效方法。FISH也被用于检测ET前单一细胞的不平衡易位。采用单细胞快速制备中期染色体的方法,结合多种FISH技术,如多重杂交FISH技术。光谱核型分析。比较基因组杂交等,大大地提高了PGD检测的准确性和有效性[8,9]。
   3.引物原位合成法(primed in situ synthesis):是一种PCR与FISH相结合的技术,同时具有两者的优点,但其实用性和结果的可靠性还有待改善。
   4.胚胎试验:早期胚胎对显微操作比较敏感,活检时容易受损。胚胎活检取材[11]方法有多种,如吸出法。挤压法。机械分离法和疝形成法等,近年出现的透明带激光打孔技术经过实践证明对妊娠率没有明显影响[3],临床应用有增加的趋势。无论通过何种方法,一旦获得活检的细胞,均需将细胞固定在载玻片上进行FISH分析。
   早期胚胎活检常选择在8细胞期进行(胚胎发育的第3天)[12],此时对胚胎的影响最小。发育至桑椹期时胚胎细胞之间形成紧密联接,使活检操作比较困难。研究表明经过活检的胚胎取出1/4。2/8或3/8个卵裂球后仍然可以正常发育到囊胚期[13],胚胎活检后妊娠率高于极体分析。然而,尚未有随机研究分析PGD过程的安全性。移植活检后的胚胎应该十分小心,因为轻微的挤压也可以通过透明带的开口将胚胎排出。
   二、PGD准确性和范围
   PGD分析非整倍体核型胚胎可以选择极体或胚胎细胞。极体细胞可以使用第一极体或第二极体,它们在胚胎发育和合子形成中是非必须的[14],因而不影响卵子受精和正常发育,且不会引起伦理学上的争议,近年来临床应用有增加趋势[3]。极体活检比胚胎活检对胚胎的创伤性小,且不为染色体的嵌合性所影响,可以间接地反映母源性遗传缺陷。尽管多数非整倍体核型是母源性的,但极体活检细胞不能检测父源性非整倍体核型或发生于受精期间及受精后的其它异常,例如多倍体。单倍体及嵌合性,它们的发生率约占胚胎核型异常的20%;而且只能取到一个细胞核进行分析,结果的可靠性有限。
   胚胎分析也可以在囊胚期进行(胚胎发育的第5天),活检滋养外胚层。由于滋养外胚层不参与胚胎的形成,此时检测的优点是取出滋养外胚层并不减少内细胞群的细胞数目。因此时可以获得较多的细胞(10~30个)进行遗传学分析,而且此阶段的胚胎基因表达更为完全,增加了诊断的可靠性,是较为理想的PGD材料。但胚胎在体外很少能发育到囊胚阶段,使该时期的PGD受到了限制,目前还罕见报道[3]。尽管引入了激光活检并改善了囊胚培养方法,许多研究中心仍然选择在胚胎发育的第3天进行检查。
   胚胎活检尽管对胚胎的损伤较大,却可以用于检测母体的非整倍体核型以及父源的非整倍体核型。多倍体。单倍体和广泛的嵌合性,诊断的准确性较高。如果有其他异常的胚胎存活,还可以通过产前诊断检测出来。尽管PGD已经成为辅助生殖中心的常规技术,但目前仍然不能对所有的遗传异常做出明确诊断[5,15,16]。
   PGD通常只需要获得1~2个细胞,同时分析2个或2个以上卵裂球可以获得较多的信息,并有助于提高诊断的可靠性[11]。FISH依赖于荧光标记的探针,目前仅能获得绿。红。蓝3种可见的荧光色素,选择联合探针可以增加染色体的检测数目[12],能在单一的细胞上同时检测XY。13。16。18。21和22号染色体[1],其有效性达90%[12],目前几乎可以同时检测全部的染色体[17]。
   文献[3]报道,截止至2000年5月1日,在进行PGD的夫妇886对。1318周期中,163例妊娠。分娩162个婴儿。PGD婴儿与ICSI的婴儿相比,新生儿问题或畸形发生率都不高。与常规ICSI分娩的1987个婴儿的情况非常相似[3,18],PGD分娩的162个婴儿中单胎占54%。双胎41%。三胎5%。其他指标,如出生体重。身长。头围两组也很相似,主要的异常发生率(2.3%)亦与ICSI组2.9%非常接近。
   三、PGD的应用
   通过PGD对遗传异常胚胎的筛检,理论上可以增加着床率,减少自发性流产和三倍体受孕的发生。随着诊断技术的提高,用于诊断的染色体异位和畸变不断增加,使各中心IVF治疗成功率稳步提高[3]。
   通过PCR进行单细胞检测的诊断获得了许多健康和遗传正常的妊娠。囊性纤维化病是1992年Handyside采用PGD确诊的第一个遗传疾病[19],10年后囊性纤维化仍然是国外PGD发现最多的疾病[3]。PGD已成功地应用于检测脊髓性肌萎缩。β地中海贫血。家族性黑蒙性白痴。血友病。脆性X综合征。镰状细胞病。视网膜色素炎。α1-胰蛋白酶缺陷。马凡综合征。享廷顿舞蹈病。范可尼贫血。色素失调症等遗传性疾病[3,12,16]。
   进行PGD的主要对象是那些可能有遗传异常或高危遗传因素,需要产前诊断的病例,尤其是那些可能同时具有两种以上不同的遗传异常情况[3,20]。主要的适应证包括具有异常妊娠结局的不育夫妇;对采用IVF或ICSI治疗的不育患者常规进行PGD;以及具有单基因疾病的不育夫妇。PGD的新的应用适应证不断涌现[3]。
   目前对同时具有多种遗传异常的患者还难以提供满意的诊断方法,虽然产前诊断的技术问题比较简单,且也可以明确诊断,但是一旦在产前诊断发现遗传异常需要终止妊娠,所以它也并不是一个良好的诊断方法,我们只有期待PGD多项诊断方法的出现,才可能解决这部分患者的问题。
   此外,PGD尚可在生殖医学研究中对精子。卵子以及早期胚胎的发育过程提供有意义的信息[21-23]。通过对冻存卵子受精后胚胎的PGD,发现染色体异常的发生率并未因冻存而增加,表明冻存对卵子的遗传特性没有显著影响[21];而采用中心型颗粒胞浆(CLCG)的卵子受精后胚胎的PGD发现染色体异常高达52.3%,尤其是与高发的流产率(54.5%)有关的非整倍体性核型异常的发生率升高[23]。
   四、与PGD相关的几个问题
   1.性别选择:性别选择可以帮助有性连锁遗传异常的夫妇获得遗传正常的婴儿。多数学者认为PGD用于非医疗原因的性别选择应该禁止,这可能导致性别偏见和性别比例失调。社会损害以及医疗资源的浪费[24]。
   2.移植胚胎数的选择:对于可能存在遗传问题的患者总希望多移植一些外观发育良好的胚胎,以增加治疗成功率,并因此导致了IVF和ICSI常出现多胎妊娠现象。PGD的广泛应用使人们有可能选择遗传特性良好的胚胎进行移植,因而减少了对胚胎数量的要求,已有报道经过仔细选择1~2个发育良好的胚胎移植以减少多胎妊娠[3]。
   3.诊断的准确性:采用PCR方法对单基因疾病的诊断有时把握性不大,原因在于PCR技术诊断的难度高于FISH[3]。造成PCR误诊的原因可能与污染有关,所以建议使用ICSI时进行PGD,以避免IVF中精子污染对PCR结果的影响,但多数PGD误诊的原因还不清楚。近年来出现的多重PCR可以将这种误诊率降低到3.4%(4/116)[5,15]。
   五、PGD的展望
   目前PGD技术已在世界广泛应用,随着PGD技术以及辅助生殖技术,尤其是IVF技术的发展,必将使PGD成为重要的临床检测手段。
   人类基因组计划研究的进展。DNA诊断分析技术以及其他技术的不断发展促进了PGD技术迅猛发展。例如,随着对人类DNA克隆数据库了解的越来越多,使我们能够针对个别家庭的独特的染色体异位或已知的基因突变而设计探针,进行有效的PGD;采用现存的荧光色素探针进行设计的46条染色体软件的应用以及将来可以扩增单一细胞的全部DNA,对含有数百或数千标记物进行杂交检测染色体或亚染色体的不平衡性,并可以检测任何一条染色体缺失。易位。重复,以及数目异常等等。
   应该进一步提高PGD诊断的准确性和可靠性,以便深入研究与男女不育症相关的染色体异常。可以传给子代的遗传突变以及胚胎遗传异常发生频率较高的染色体,对多基因疾病,例如恶性肿瘤。糖尿病。冠心病等的PGD也将成为可能。

子言听雨 · 发表于 2011-12-14 10:43:43

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