[转载］全基因组扩增 ——微量DNA分析的金钥匙

小丫

2012-3

+ V: a) [$ k3 f; Y) B1 B4 D聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大地促进了法医学、古生物学、分子诊断学和分子病理学的发展。但即便是对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PCR反应。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增技术应运而生。
# F$ u3 s* M* C: U, w% g2 m　　一、全基因组扩增的概念
* w2 \9 t: b2 r　　全基因组扩增（whole
genome amplification,
$ `/ V) m7 s" A4 g/ m; `* |2 m0 R$ \WGA）是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。常用的方法有IRS-PCR（interspersed
repeat sequence PCR）[sup]［1］[/sup]、LA-PCR（linker adaptor
- ^9 r+ A8 @& Z6 ^) u' ^  zPCR）[sup]［2］[/sup]、T-PCR（Tagged-PCR）[sup]［3］[/sup]、DOP-PCR（degenerate
7 M" O; b6 P! {' s7 o4 P: \; ooligonucleotide primed PCR）[sup]［4］[/sup]、PEP-PCR（primer extension
" X* i4 y# M  b! k  @6 F$ mpreamplification
# S4 a6 V) ?7 V2 u) ^( b$ ePCR）[sup]［5］[/sup]等。其中最具代表性方法是DOP-PCR和PEP-PCR。
0 n5 p1 D  ]- {' J  |0 x% i) K( D　　DOP-PCR和PEP-PCR的基本原理都是通过其随机引物与基因组DNA多处退火从而使大部分基因组序列得到扩增。DOP-PCR的引物是由其3′和5′端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。其PCR程序是先在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度，进行几十个循环的严谨扩增。由于DOP-PCR的引物3′端设计的是在基因组中高频出现的序列，因此，在首轮的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大[sup]［4］[/sup]。与DOP-PCR不同的是，PEP-PCR的引物是由15个随机核苷酸组成的完全随机引物。PCR由50个循环组成，每个循环的退火温度都是由37℃连续升温至55℃，从而确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，使整个基因组得到放大[sup]［5］[/sup]。
/ C; `# C2 |; p　　二、全基因组扩增的质量控制
　　全基因组扩增的主要目的是在如实反映基因组原貌的基础上最大限度地增加DNA量。因此，扩增效率和保真性是衡量全基因组扩增技术优劣的主要标准，此外，扩增片段的大小对于序列较长的基因片段分析来讲也是一个重要因素。
* i3 ]  Q- Y! B( A　　（一）扩增效率
2 h. ]2 R4 c# u　　DOP-PCR和PEP-PCR均能较大幅度地扩增模板DNA的量。据Cheung等[sup]［6］[/sup]报道，DOP-PCR可将原模板扩大12至2万倍，而且，模板量越少，扩增倍数越高，这主要是由于受到DNA聚合酶和引物量的限制。PEP-PCR的精确定量研究尚未见报道，但就Zhang等[sup]［5］[/sup]的保守估计，一个单一基因组拷贝的精子在PEP-PCR后至少有78%的基因组序列可以扩增30倍以上。也有人报道，PEP-PCR的扩增效率可以在1
/ p! m1 e3 G/ Q, W! [, M/ u. p4 I000倍以上[sup]［7］[/sup]。不同的模板扩增效率差别很大，一般说来，新鲜完整的细胞，如体外培养的细胞、外周血淋巴细胞等扩增效率最高，而组织切片，特别是经甲醛溶液固定的石蜡切片DNA扩增效率最低[sup]［8］[/sup],可能是由于在切割制片及后续处理中DNA受损质量下降所致。但即便如此，其扩增效率仍然非常可观。Duddy等[sup]［9］[/sup]报道，3
μm的石蜡切片上1
% o" Y' a! L+ n+ F) a9 wmm[sup]2[/sup]的细胞经PEP-PCR扩增后，可进行10～100个位点的分析。
　　与特异位点PCR不同，DOP-PCR和PEP-PCR的引物在整个基因组上有多个退火位点，因此相同量的引物和DNA聚合酶在前几个循环内便达到饱和而进入线性增长期，因此全基因组扩增效率的主要限制因素是DNA聚合酶和引物的量[sup]［4，10］[/sup]。实验也证明，在一定范围内增加引物和DNA聚合酶的量可以提高扩增效率，但过高的引物和酶量会由于引物自连形成过多非模板相关序列[sup]［4］[/sup]。WGA和后续的PCR循环数较多，时间较长，这对于DNA聚合酶的耐热性和保真性是一个考验。已有人用比Taq酶耐热性和保真性更好的DNA聚合酶Vent进行WGA[sup]［7］[/sup]，也有人证明用高保真聚合酶能提高WGA的产率[sup]［8］[/sup]，可能是由于后者的3′～5′的DNA外切酶活性可以校正在低严谨条件下不完全匹配的引物3′端，使之延伸更有效。另外，Dietmaier等[sup]［8］[/sup]认为，细胞的裂解法对于WGA的扩增效率也有影响。
　　PEP-PCR和DOP-PCR相比较，DOP-PCR扩增效率可能高于PEP-PCR，Wells等[sup]［11］[/sup]用琼脂糖凝胶电泳EB染色的方法可以在紫外光下看到DOP-PCR产物的弥散带，但却不能看到PEP-PCR的产物；利用DOP-PCR从一个细胞制备的比较基因组杂交涂染探针可以呈现令人满意的杂交效果，而PEP-PCR制备的比较基因组杂交探针的杂交信号非常微弱。
$ j4 H6 j% S: J4 @# Y, Q　　（二）序列保真性
　　WGA要求扩增DNA能如实反映模板原貌，这包括两层涵义：一是全部或绝大部分基因组序列能被以相同的比例扩增，即覆盖率问题；二是尽量减少原模板中不存在的序列。PEP-PCR由于引物全部序列均为随机，其种类多达4[sup]15[/sup]，这便保证了它可以与基因组随机退火，从而使整个基因组得到放大[sup]［10］[/sup]。实验也证实了PEP-PCR可以扩增几乎整个基因组[sup]［12］[/sup]。DOP-PCR的引物并非完全随机，与基因组的退火有一定序列倾向性，对质粒和粘粒等复杂性低的模板的扩增也证实了这一点[sup]［4］[/sup]。但就目前的多遗传位点的分析看，多数位点都获得了成功[sup]［6，11，13］[/sup]，表明DOP-PCR可以覆盖大部分基因组。
. X; [$ F( [& \7 c　　对于双倍体的细胞来说，PEP-PCR、DOP-PCR均遇到一个能不能对两个等位基因同倍扩增的问题。几乎所有的研究组都观察到在细胞数量较少时，DOP-PCR和(或)PEP-PCR都会不均一扩增两个等位基因，造成人为的等位基因“缺失”（allele
drop-out）从而被误认为杂合性缺失(loss of
- s9 h- c& b* T' C" rheterozygo-sity)[sup]［6-8，11，13，14］[/sup]，这种现象也见于单个细胞的DNA片段扩增[sup]［15］[/sup]。虽然不能排除在WGA扩增后DNA总量仍很少的情况下，由于WGA后续特异位点PCR偏差所致，但人们普遍认为造成等位基因“缺失”的主要原因是WGA扩增过程中由于模板量少而退火偶然性增大所致[sup]［6-8］[/sup]，因为对相同标本进行多次WGA会出现不同等位基因的等位基因“缺失”[sup]［14］[/sup]；而同一WGA扩增产物多次取样进行PCR的等位基因“缺失”模式相同[sup]［11］[/sup]。为减少这种人为误差，人们规定了原始标本量的低限。但由于研究材料和方法的差别，不同研究组的标准相差很大，如Dietmaier等[sup]［8］[/sup]用10个体外培养的SW480细胞经改进的PEP-PCR扩增便可以获得可信的结果；而Barret等[sup]［14］[/sup]则需要50～100个流式细胞仪分选的食管癌细胞才能达到两个等位基因的同倍扩增。对于甲醛固定的石蜡切片，Dietmaier等[sup]［8］[/sup]认为250个细胞就可以避免等位基因“缺失”的出现，而Kim等[sup]［13］[/sup]则认为DNA量不应该少于20
! ]- ]: }0 U- {ng（>1
000个细胞）。对只能获得单个细胞的标本，如从母体外周血分离到的胎儿细胞，人们建议通过多次独立的WGA扩增以减少人为偏差的可能[sup]［7］[/sup]。
　　由于WGA的扩增和后续PCR反应的循环数有近百次或更多，因此，DNA聚合酶的保真性是一个重要问题。尽管Taq酶有一定的错误率[sup]［16，17］[/sup]，但就目前的研究来看，WGA中由Taq酶引入的点突变的比例并不高[sup]［7，8，11，18］[/sup]。但仍有人用高保真聚合酶代替Taq酶，以减少这种可能性[sup]［8］[/sup]。
　　对于微卫星等重复序列讲，在DNA量太少的情况下，除上述等位基因“缺失”和点突变外，还会产生微卫星片段长度的突变，一般表现为一个或几个重复单元的插入或缺失，这种现象有一定位点特异性，可能与位点所在区域的染色质结构、GC含量等因素有关[sup]［11］[/sup]。据认为可能是由于在WGA低严谨扩增条件下的链的滑动所致，因为对于未经WGA扩增的单细胞微卫星分析没有发现这种现象[sup]［19］[/sup]。
- w' s/ G: y1 y2 D2 C( h　　（三）扩增片段的长度
0 m8 w6 M9 u7 w$ O7 a( |　　片段长度是DNA质量的一个重要指标。一般说来，DOP-PCR、PEP-PCR的扩增产物对于500
& q% m/ J- v, `/ dbp以内的序列分析没有问题[sup]［6，11，14，19］[/sup]。有报道PEP-PCR的扩增片段最多有800
bp[sup]［5］[/sup]，而DOP-PCR的扩增片段可达1.5
kb[sup]［11］[/sup]。
　　综上所述，DOP-PCR与PEP-PCR相比，DOP-PCR在扩增效率和DNA片段长度方面优于PEP-PCR；而在覆盖率上不及后者，尤其是在DNA量少的情况下。
　　三、WGA的应用及注意事项
/ g% I+ P+ @1 }4 p　　WGA是一种能大量增加原始模板DNA的技术，对于原始材料很少的法医学、古生物学；对于只能从母体外周血和羊水中获取单个细胞的产前诊断；对于从有限标本进行多个位点遗传分析的肿瘤分子病理学来说，都有广阔的应用前景。DOP-PCR主要用于原位杂交[sup]［4，20］[/sup]和比较基因组杂交[sup]［11，13］[/sup]的染色体特异探针和涂染探针的制备，近来也被用于微量DNA的分子遗传研究[sup]［11］[/sup]。PEP-PCR最早用于精子基因型分析[sup]［5］[/sup]，后来在遗传病的产前诊断[sup]［7，18］[/sup]和微量纯化肿瘤细胞的遗传异常分析中广泛应用[sup]［8，9，14］[/sup]。另外，值得一提的是，WGA可以提高肿瘤杂合性缺失分析的敏感性[sup]［8，14］[/sup]，这可能是由于WGA的多次PCR反应使肿瘤细胞和肿瘤组织中混杂的少量正常组织的差别更加显著。这对于在肿瘤病人的尿、痰等混杂有正常组织的临床标本上进行微卫星分析，从而无创性诊断肿瘤具有重要意义。
　　WGA最主要的问题是人为的假象。因此在做结论前应该慎重，尤其是以诊断为目的时，应该尽量增加原始模板的量、分别多次独立检测和使用高保真的聚合酶以减少人为假象的出现。
& ~, P' _6 \6 H5 g, f　　四、展望
　　WGA已经在精子、胎儿细胞、淋巴细胞、组织切片等标本的微量分析中显示出强大优势，但如何减少甚至避免小量标本的扩增假象将是今后一个重要课题。另外，对肿瘤病人血浆、尿、痰等体液中的DNA的扩增应用于肿瘤的无创性诊断及对经过处理的DNA如转甲基后的DNA、RNA逆转录成的cDNA进行扩增将是一个很有前景的发展方向。
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6 p$ X# Z3 T, X/ S3 s( E# K1 o

基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(G1998051207)

作者单位：张建军（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室　100021 北京）
* P* U6 n: a  L6 T5 }( U& s# j高燕宁（中国医学科学院
9 p+ d7 l6 q  d8 Z中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室　100021 北京）
% T8 R& b' k3 @+ j/ N程书钧（中国医学科学院 中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室　100021
# H% q) V" r1 ?" q  E! ]) \北京）

. H8 Z; l/ V% r
( _' l5 x+ S1 g. y% g

参考文献

7 y5 W0 n* `& k8 b4 d/ V" X
( `3 ]8 p# l: g  M  [

　1，Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, et
al. Alu polymerase chain reaction: a method for rapid isolation of
human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sci U S A,
: p( z  i- O) h, X( i3 k4 ]- y1989, 86: 6686-6690.
　2，Lüdecke HJ, Senger G, Claussen U, et
al. Cloning of defined region of the human genome by microdissection of banded
chromosomes and enzymatic amplification. Nature, 1989, 338:
348-350.
$ I2 x5 z3 B, [　3，Grothues D, Cantor CR, Smith CL. PCR amplification of megabase
4 K, y  e4 k, Q. s& LDNA with tagged random primers (T-PCR). Nucleic Acids Res, 1993, 21:
3 U1 s: c3 W# S. g: h; ?/ N" W! |1321-1322.
　4，Telenius H, Carter NP, Bebb CE, et al. Degenerate
oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single
1 Z7 Q# j! f( X9 Q. ~- w0 {degenerate primer. Genomics, 1992, 13: 718-725.
4 k% v* b1 G! b8 H. {7 Z; t( v　5，Zhang L, Cui X, Schmitt K,
et al. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic
analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89: 5847-5851.
　6，Cheung VG, Nelson
SF. Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows
, H$ B* F3 N; ]  h( Bhundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA.
Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93: 14676-14679.
　7，Paunio T, Reima I,
Syvanen AC. Preimplantation diagnosis by whole-genome amplification, PCR
( Z& J" |- U" E. ~9 N0 mamplification, and solid-phase minisequencing of blastomere DNA. Clin Chem,
( g% _6 q5 M; b0 |; K0 ]( z; s1996, 42: 1382-1390.
　8，Dietmaier W, Hartmann A, Wallinger S, et al. Multiple
mutation analyses in single tumor cells with improved whole genome
; k+ c" p, n8 y; a" w  b8 `amplification. Am J Pathol, 1999, 154: 83-95.
5 l3 i+ m1 o' p' Z, i: B  f　9，Duddy SK, Gorospe S,
Bleavins MR. Genetic analysis of multiple loci in microsamples of fixed
paraffin-embedded tissue. Toxicol Sci, 1998, 46: 317-323.
10，Sun F, Arnheim
N, Waterman MS. Whole genome amplification of single cells: mathematical
; J! V: N( o  v0 |* R- F. R$ Zanalysis of PEP and tagged PCR. Nucleic Acids Res, 1995, 23:
3034-3040.
11，Wells D, Sherlock JK, Handyside AH, et al. Detailed chromosomal
! e) y( Q, \; L3 s0 `4 d! Wand molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and
comparative genomic hybridisation. Nucleic Acids Res, 1999, 27:
: r6 q/ h/ Q, z8 Z+ u1 z- R1214-1218.
  [* Q. c: m- ?- h12，Barrett MT, Galipeau PC, Sanchez CA, et al. Determination of
! m1 i! G& T& Y/ R! T5 _the frequency of loss of heterozygosity in esophageal adenocarcinoma by cell
sorting, whole genome amplification and microsatellite polymorphisms. Oncogene,
1996, 12: 1873-1878.
( F% T5 Z3 Z' d4 _; W5 b13，Kim SH, Godfrey T, Jensen RH. Whole genome
amplification and molecular genetic analysis of DNA from paraffin-embedded
prostate adenocarcinoma tumor tissue. J Urol, 1999, 162:
1512-1518.
14，Barrett MT, Reid BJ, Joslyn G. Genotypic analysis of multiple
4 _9 k' }$ t9 w* j5 lloci in somatic cells by whole genome amplification. Nucleic Acids Res, 1995,
23: 3488-3492.
( M  O  a' b, z15，Ray PF, Winston RM, Handyside AH. Reduced allele dropout in
single-cell analysis for preimplantation genetic diagnosis of cystic fibrosis. J
4 W4 ~9 t, b6 u% V4 UAssist Reprod Genet, 1996, 13: 104-106.
16，Keohavong P ,Thilly WG. Fidelity
of DNA polymerase in DNA amplification. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86:
9253-9257.
17，Cariello NF, Thilly WG, Swenberg JA, et al. Deletion
& `1 b  S+ e' G" J. nmutagenesis during polymerase chain reaction: dependence on DNA polymerase.
Gene, 1991, 99: 105-108.
18，Snabes MC, Chong SS, Subramanian SB, et al.
2 c* J3 ~+ f3 |Preimplantation single-cell analysis of multiple genetic loci by whole-genome
amplification. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91: 6181-6185.
, n& n( k+ R1 {5 N: F- J  Y19，Sherlock J,
0 b, x5 ~: u. T7 ~* P- F' R4 \Cirigliano V, Petrou M, et al. Assessment of diagnostic quantitative fluorescent
4 A9 w" ^4 @! b/ Smultiplex polymerase chain reaction assays performed on single cells. Ann Hum
9 b" D3 v6 H3 f* c- k7 }5 Y$ {Genet, 1998, 62(Pt 1): 9-23.
$ }+ q; x, @* h+ q2 w& a3 X8 O20，Telenius H, Pelmear AH, Tunnacliffe A, et al.
Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted
chromosomes. Genes Chromosomes Cancer, 1992, 4: 257-263.