精子冷冻的程序、方法及步骤

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冷冻程序人类精液在冷冻过程中，必须通过以下5个温度阶段：①温度休克阶段，室温～5℃；②冰晶潜热阶段，5～-5℃；③冰晶形成阶段，-5～-15℃；④再结（冰）晶阶段，-15～-80℃，⑤贮存阶段，-80～-196℃。根据精子在各温度阶段理化性质的变化，应采取不同的降温速率，以获得理想的精子冷冻复苏率。
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一、温度休克阶段 在此温度阶段，由于温度的急剧变化而对细胞造成的损伤称为温度休克，许多种属的细胞，在冰晶形成之前，由于温度的突然下降而致死。如牛的精子以每分钟2℃进行降温就可能在冰晶形成前死亡。相较其他种属的精子和细胞而言，人类精子对冷冻休克的抵抗力较强，大部分精子对冷冻休克不敏感。温度的降低对细胞的新陈代谢功能可能会产生一定影响，如糖的利用降低。在人类精子冷冻过程中，以1～1.2℃/min的降温速度通过温度休克阶段较理想。
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* Q# t5 ~$ \5 R9 s. ]; C% d8 l 二、冰晶潜热阶段 在此温度阶段，精液成分由液相转变为固相，物质发生相变。冰晶潜热是指在温度保持不变的情况下，单位质量的物质由液态转变为固态所释放出热量，随着精液冷冻过程的继续，在通过5℃～-5℃温度阶段时，精浆内形成冰晶，释放出大量热量，突然升高的温度，会对精子造成损伤。为了减少潜热释放对精子造成的损伤，冷冻时应以5～7℃/min的降温速度通过此阶段。
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三、冰晶形成阶段 人类精子中含有约0.15mol NaCl的溶质，因此，精子细胞的冰点应约为-0.6℃左右，和人类其他细胞一样，在温度不低于-10℃时，大部分精子细胞内并不形成冰晶，处于过冷状态。随着冷冻过程的继续，温度由-5℃降低到-30℃，尤其在-5～-15℃阶段，精液整体由液相变为固相，伴有大量冰晶的形成和温度的急剧变化，在此过程中，如降温速度缓慢，冰晶将会围绕最先出现的少数几个冰晶而形成，随着温度的持续下降，已形成的冰晶将逐渐增大，而不是形成新的冰晶，因为从能量的角度看，形成一个新的冰晶比使已存在的冰晶增大更加困难，但是，体积和形态均已发生变化的大冰晶对精子细胞器结构和细胞膜均可造成不可逆的损伤；但如降温速度过快，精子没有充足的时间通过水分的向外渗透来维持细胞内外溶液的渗透压平衡，细胞内溶液过冷，为达到内外渗透压平衡，细胞内最终会形成大量冰晶。因此，应快速通过此阶段，降温速度以5～7℃/min为宜。
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6 s7 R0 I; f  l1 Q/ ~! x  H5 G" j9 P四、再结（冰）晶阶段 在此温度阶段，冰晶形成阶段所形成的小冰晶，因其具有较高的表面能量，有发生再结晶的趋势，以减少他们的表面能量，再结晶亦称重结晶，是冰晶与冰晶融合的过程。此阶段由于冰晶的生长和相互作用，温度波动加剧，细胞内电解质平衡被打破和重建，造成精子的进一步损伤。通过提高降温速率，以30～50℃/min的降温速率快速通过此阶段可避免这种损伤。
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五、贮存阶段 精子贮存阶段为-80～-196℃，精子进行程序冷冻时，以30～50℃/min的降温速度由-80℃降至-130℃，再直接投入液氮中贮存，此阶段精子新陈代谢降低，基本处于休眠状态。

精液冷冻的方法
, R5 y) B' P8 n近50年来，关于精子冷冻的方法，人们进行了大量研究，冷冻所需时间从最初的耗时10h改进到现在进行玻璃化冷冻仅需10s左右。现阶段，常规精子冷冻以三阶段降温法应用最广，即依据精子冷冻过程中的理化变化，分为三个不同的温度阶段，以不同的降温速率依次降温。近年来，有关精子玻璃化冷冻技术的研究也有大量报道，尤其在胚胎冷冻过程中，玻璃化冷冻较传统的冷冻方法有较大优势，表现为操作简便、耗时短、费用低、冻融效果好、存活率高、无冰晶形成，在细胞冻融过程中损伤小。

0 t4 b5 `" a- B/ B* ` 一、慢速冷冻法：将精液与保护剂混合分装后，室温平衡10min，运用程序冷冻仪以1℃/min速度降温至4℃，然后以2～3℃/min的降温速率使温度由4℃降温至-30℃，再以10℃/min的速率降至-80℃以下，放入液氮中贮存。
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& X1 u- D. x- k/ B$ o 二、快速冷冻法：将精液标本在4℃冷水预冷10min或4℃冰箱冷藏室中预冷20min，再将精液标本置液氮表面上2cm 处5～7min后浸入液氮中贮存；或直接将精液标本置液氮表面上5cm处10～20min后浸入液氮中贮存；也可在程序冷冻仪上以1℃/min降至4℃后，再以5～7℃/min降温至-30℃，以30℃/min降温至-80℃后浸入液氮中贮存。

三、玻璃化冷冻法
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精子冷冻的具体步骤
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) M0 G1 e% h2 J, D/ V1 y快速液氮蒸气冷冻方法操作步骤
! @4 Y) x# q2 v精液冷冻常用的方法有两种，即快速液氮蒸气冷冻法及程序冷冻仪冷冻法。现将精子库的具体操作步骤介绍如下：
: Z5 R- Q- G% j/ x快速液氮蒸气冷冻方法操作步骤
精液取出后，在37℃水浴摇床内液化。
待精液充分液化后取样，按照《WHO人类精液检查及处理实验室手册》（第五版）的方法进行精液分析，内容包括精液体积、颜色、气味、pH值、液化情况、精子浓度、精子活力、存活率以及圆细胞等，并认真做好实验记录。
在进行精液分析的同时将冷冻保护剂复温至室温并平衡30min以上。
5 d7 r5 @# u+ P" y4 |: }6 ^根据精子浓度和活力情况，按照1∶1、1∶2或1∶3（冷冻保护剂∶精液）的比例缓慢加入冷冻保护剂，边加边混匀。
将精液与冷冻保护剂充分混匀。
" _- ^# X% j3 d7 C# @将混匀的精液分装至冷冻管或麦管内。 在冷冻管或麦管上标记或贴上打印好的标签。
; A3 u! r% p2 X  m4 Y2 p4 C5 [) L& `9 [将冷冻管或麦管置入4℃冰箱内保持20min。
# V4 t$ c% I3 N将冷冻管或麦管置于液氮表面2cm处保持5～7min。
将冷冻管或麦管放入保存盒，直接投入液氮保存。

程度冷冻仪冷冻方法操作步骤

, @' L) z3 q7 a' _  M1.按照上述快速液氮蒸气冷冻方法第1步至第7步进行操作。
2.将已标记的冷冻管或麦管置于程序冷冻仪内，开始程序冷冻。
降温速率按以下程序设计： 20℃，平衡5min； 20～4℃，冷冻速率1.2℃/min 4～-30℃，冷冻速率7℃/min -30～-130℃，冷冻速率30℃/min。
  ~9 @$ m& [- C% h9 G6 x1 {3.冷冻结束后，取出冷冻管或麦管放入保存盒，直接投入液氮保存
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