精子冷冻保护剂

小丫 · 发表于 2021-2-22 21:20:13

研究表明，未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后，仅有0.1%的精子具有一定程度的运动能力。在精子冷冻之前，为了减轻精子冷冻及复温过程中细胞的损伤，获得理想的冷冻复苏率，必须加入一些具有保护作用的物质，这些物质统称冷冻保护剂。作为冷冻保护剂需具备如下两个条件：第一，对被冷冻细胞无毒性或很低毒性；第二，具有高的水溶性，可与水以任何比例混合，确保在冰晶形成初期，稀释细胞外液中溶质的浓度。在冷冻过程中，渗透性保护剂渗入细胞内，替代水分延缓了细胞内水分的减少及由此引起的溶质浓度增加，减轻细胞皱缩的程度，保护细胞顺利通过冰晶形成阶段。

冷冻保护剂分类
根据化学结构分类：醇类、酰胺类、高分子多糖类、单糖类、蛋白质类、无机盐类等。根据冷冻保护剂的作用机制分类：渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。
渗透性冷冻保护剂渗透性冷冻保护剂也称膜内保护剂，如甘油、二甲亚砜（DMSO）、丙二醇、甲醇、葡萄糖等，均为小分子化合物。这类保护剂极易通过细胞膜进入到细胞内，降低胞质中溶质浓度，减少进入细胞内电解质的量，减轻冷冻及复温过程中细胞渗透性肿胀，减缓细胞皱缩的程度，有效降低细胞内冰晶形成的温度，阻止或减少冰晶的形成。多数渗透性保护剂是水溶性强的小分子物质。甘油是发现最早，也是迄今为止应用最为广泛的精液冷冻保护剂，他具有高渗透性，可与水以任何比例混合，能起到稳定细胞内电解质的浓度，防止蛋白质变性的作用，同时也可使细胞内冰晶形成的温度显著降低，减少或阻止细胞内冰晶形成。甘油还可以渗入细胞内使细胞内外渗透压平衡，减缓细胞的皱缩程度。甘油在温度低于0℃时扩散进入细胞较为困难，因此，冷冻前，在室温下先将精子与冷冻保护剂平衡10～20min，可起到减少细胞冷冻损伤的效果。
非渗透性冷冻保护剂
非渗透性冷冻保护剂也称膜外保护剂，如果糖、蔗糖、蜂蜜和一些高分子化合物，如聚乙烯吡咯酮、右旋糖酐、卵黄、白蛋白等，这类物质不能穿过精子细胞膜，其作用是通过维持细胞膜的稳定来保护精子。此外，他能够提高细胞外渗透压，在冷冻过程中使细胞内的水分快速向细胞外渗出，减少细胞内水分，从而减少细胞内冰晶形成，保护细胞免遭因冰晶形成而造成的机械损伤。非渗透性保护剂中，白蛋白具有降低精子细胞的氧消耗量、减少活性氧产生的作用。卵黄中的卵磷脂黏附在细胞膜上，可起到稳定精子细胞膜，阻止顶体膜破裂的作用。冷冻精液复温时，由于非渗透性保护剂在细胞外液形成的高渗浓度，可以有效防止水分快速进入细胞引起的肿胀破坏。

冷冻保护剂的配制方法
研究表明，精子冷冻过程中，含卵黄的冷冻保护剂比不含卵黄的冷冻保护剂效果好。现常用的冷冻保护剂均以甘油-卵黄-枸橼酸钠（GEYC）复合剂为基础改良配制而成。通过观察精子冷冻复苏后的超微结构发现，GEYC比单独使用一种成分的保护剂效果好，现将GEYC精子冷冻保护剂及《WHO人类精液检查及处理实验室手册》（第五版）推荐的保护剂配方介绍如下：
GEYC的1∶1配方

已有与GEYC配方相似商品化的冷冻保护剂，因为冷冻保护剂中添加了青霉素和链霉素之类的抗生素，使用时应注意个别受精者发生过敏反应。

GEYC的1∶2配制
《WHO人类精液检查及处理实验室手册》（第五版）推荐的GEYC冷冻保护剂1∶2的配制方法：
称量1.5g葡萄糖和1.3g含2个水分子的柠檬酸三钠，加消毒的纯净水至65ml。
加入15ml甘油完全混匀。
加入1.3g甘氨酸，等完全溶解后用0.45μm微孔过滤器过滤。
加入20ml新鲜蛋黄（最好由特定的无病原蛋中获得）：清洗鸡蛋，去壳，刺破卵膜，用注射器吸取卵黄（每只鸡蛋可获得约10ml卵黄）。
所制成的悬浮液置56℃水浴箱中孵育40min，经常搅拌。
检测溶液中的pH值，如果pH值在6.8～7.2范围之外，这样的溶液是不理想的，应该丢弃重新制备，以防加入了不正确的试剂成分或剂量。
细菌培养可在这一环节进行，以检测溶液是否无菌。
精子毒性试验也可以在此环节进行。
在超净台中将溶液以2ml分装，-70℃保存。
在3个月之内使用。

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