下一代测序技术（NGS）展望

小丫

     

+ f! v( B+ ^1 W1 B自从哈佛大学遗传学家 George Church 和 454 Life Sciences 公司 Jonathan Rothberg 掀起下一代测序 NGS  的革命以来，已经过去了将近十年。毫不夸张地说，这段时间以来 NGS 技术已经发生了翻天覆地的变化，在测序通量突飞猛进的同时，测序成本直线下降。     
        想当年 454 Life Sciences 公司测序 580-kb 的细菌基因组，需要四小时的工作循环。而今年一月份 Illumina 公司发布的  HiSeq X? Ten 测序系统，能够以千元成本测序完整的人类基因组，最多每天能测序 600 billion bp。     
        如今，下一代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变。而 NGS 领域本身也在经历着某种意义上的变革。正因如此，基因组学 Archon X 奖（Archon  Genomics X Prize）不得不于 2013 年 8 月宣布取消，因为测序成本的直线下降已经使竞赛变得毫无意义。Church  的团队是该竞赛仅有的两只报名队伍之一，他认为参赛者们是否能够完成竞赛任务还很难预料。但无论如何，既然竞赛已经启动，总得让人家比完吧。     
& L5 |5 J) T0 B9 x- w& p        言归正传，下一代测序领域的 2013 年既忙碌又喧嚣，在开年之际让我们对这一领域发生的最新进展做个小结吧。     
% [& Z3 e3 a* x2 H/ M3 I) V454 Life Sciences     
        2013 年 10 月， 454 Life Sciences 宣布将于 2016 年中旬逐步淘汰其焦磷酸测序仪器，GS Junior 和 GS  FLX+。据该公司介绍，从扩展性和成本角度看，454 平台作为首个商业化的 NGS 系统已经基本上走到尽头，很难再对其进行升级和改良。Roche 的 Beth  Button 指出，公司正在寻求新的测序合作伙伴。2013 年 9 月，该公司宣布与昔日的竞争对手 Pacific Biosciences 合作，拟基于  PacBio 公司的SMRT技术进行诊断产品的开发。     
( Z+ t2 h5 K) H( z% X- MIllumina     
        2014 年 1 月 Illumina 公司发布了两个以 Solexa 测序技术为基础的新测序平台，HiSeq X Ten 和 NextSeq? 500。     
( I7 b8 d: ?. F  u- O$ K4 j$ L  ^        据该公司介绍，定 价$250,000 的台式 NextSeq 500  兼具了样品制备和测序功能。“它按钮式的操作，可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达 16 个外显子组。”NextSeq  500 运行 75 个测序循环只需 12 小时。     
; Z: m& H5 e' @, B% Q* aHiSeqX Ten 系统以 10 台仪器为单位销售，据称可以实现千元成本的人类基因组测序。该系统现定价 1000 万美元，能够在三天时间内生成 1.8  terabases 的数据，相当于每天约 600 Gb，比 HiSeq 2500 强十倍。     
        华盛顿大学的 Elaine Mardis 表示，HiSeqX Ten  系统针对的应该是提供人类基因组测序的服务产业，因为很少有研究机构能用到如此高的通量。“要想实现千元成本，就需要正确的样本量，”她说。当然，高通量还意味着更为复杂的数据分析。     
Mardis 的团队曾作过计算，为了跟上 HiSeqX Ten 他们可能需要花费 800 万美元在信息学设施上。此外，实现千元成本意味着每年需要测序  18,000 到 20,000 个基因组。“我要测序许多肿瘤基因组，”她说。“但数量还远远不够。”     
Life Technologies     
已被 Thermo Fisher 收购的 Life Technologies 拥有两款 NGS 平台， SOLiD 和 Ion Torrent 。据  Thermo 的 Andy Felton 介绍，公司已经将工作的重心放在后者身上。“绝大多数研发工作已经转移到 Ion 上，”他说。     
' y" M4 s( r2 F7 {6 ?# f4 \        目前的 Ion PGM 系统可使用最新的 Ion 318 芯片，产出多达 6 million 400bp 的读取，也就是说 4 小时运行的产量能达到 2  Gb。而新 Ion Proton? 使用 Ion PI? 芯片，能够产出 80 million 200 bp 的读取，即每次运行产量达到 10 Gb 至 14  Gb。     
        据介绍，今年公司将会推出用于转录组测序的新 Ion PII 芯片，每张这样的芯片可产出 300 million 100bp  的读取，随着系统改良甚至可能达到 200bp。     
: g. P. h/ a% Z/ g: {        此外， Life Technologies 公司正在研发一种新的聚合酶，Hi-Q。据 Felton 介绍，Hi-Q 能“显著提高精确性”，减少 90%  的插入/缺失误差。这种酶将于今年的中旬实现全面商业化。     
  S; L' ~& o1 }- TPacific Biosciences     
3 `7 D% Z0 V, `: V4 B' X" T' h8 f        Pacific Biosciences 公司以长读取的下一代测序技术著称。据该公司的创始人 Steve Turner 介绍，在新测序化学 P5-C3  的帮助下，如今 PacificBio 的测序读长已经达到了  8.5kb。P5-C3“提供了一个保护性的支架”，可以阻止酶和荧光团之间发生身体接触，避免酶受到潜在的光学损伤。     
1 w6 h# n  I4 E4 u, A* \6 i“我们已经很大程度上减少了系统中的光学损伤，我们相信现在测序读长受到的限制，只来自于样品本身，” Turner 说。  样品本身的限制是指，读长越长就越难生成不含损伤位点或缺口的测序模板，而这样的缺口会导致测序过早中止。     
3 w  Q/ N# c" o( m2 |( i; F* b. Q$ M; \        目前 PacBio ? RS II 和 SMRT Cell 系统，每次运行可产出 50,000 个读取（约 400 million  bp）。这一数字会在接下来的一年中继续增涨， Turner 说。“我们预计在 2014 年内，令测序读长再增加50%，并于 2015 年达到  20,000bp。”     
最近研究人员发表文章向人们展示，在新装配方法 HGAP 的帮助下（hierarchical genome-assembly  process），可以实现只利用 PacBio 化学法对真核基因组进行从头装配。一月份，该公司公布了对黑腹果蝇（Drosophila  melanogaster）进行的完整二倍体基因组装配，生成了长达 24.6 Mb 的重叠群（contigs）， N50 值为 15.2 Mb（ N50  值反映了重叠群的长度）。就在上周， PacBio 公司又公布了一个 54x 覆盖度的单倍体人类基因组装配，生成了“3.25 Gb 的基因组装配，重叠群 N50  值为 4.38 Mb，其中最长的重叠群达到 44 Mb。”     
Oxford Nanopore     
% ^# {1 g3 Z% ~$ O1 Z$ @        Oxford Nanopore 公司无疑是纳米孔测序的领导者，这一技术也被称为第三代测序。该公司 2013 年 10 月份宣布，将在 2014 年年初推出  USB 大小的 MinION ? 测序仪，为客户提供先期体验（early-access）。     
5 g% _0 T7 r! N' ?        与其他类似先期体验项目不同的是， Oxford Nanopore  公司不会局限于传统的测序中心，而是向广大的个人用户敞开大门。该公司准备在接下来的一周发出邀请。     
Oxford Nanopore 公司强调，不是每个 MinION Access Program（MAP）申请者都会在第一轮受到邀请，而且公司提供的  MinION 数量也可能少于申请者的要求。这些仪器将在六周内进行发送。     
2012 年， Oxford Nanopore 公司在 AGBT 大会上描述了两个测序系统， MinION 就是其中之一，另一个产品是  GridION?。据公司发言人称， MinION 的大小使其更容易受到人们的关注，它的灵活性和测序能力将推动 NGS 进一步迈向普罗大众。     
! ?% a( ~3 s3 J/ W9 f* v( COxford Nanopore 公司希望通过 MinION Access Program  评估测序系统的实用性、对不同应用的适应性、数据分析、以及公司的物流运输和试剂分配等。这些数据将有助于未来开展的 GridION  先期体验项目，不过该公司还未公布这一项目的具体启动时间。     
广泛的应用前景     
/ h. X; {8 E3 f1 S        在下一代测序技术不断进步的同时，它的应用也越来越广泛。据 Mardis 介绍，下一代测序在临床领域的应用快速增涨。越来越多的研究者选择下一代测序的多基因  panel 对肿瘤进行研究，或者通过外显子测序鉴定潜在的药物靶点。在诊断儿童遗传学疾病时，人们也逐渐抛开了传统的诊断方法，转而使用全外显子组测序。     
: J8 Z0 F' D9 X0 d: f* p! xMardis 补充到， NGS 检测有两大优势，它既可以帮助人们确定治疗方案，也可以为患儿父母评估他们未来子女患同样疾病的风险。实际上 Church  认为，用下一代测序进行（致病基因）携带者筛查，是 NGS 的“杀手锏”。     
“任何考虑使用辅助生殖手段的人…都应当知道精子捐献者是否携带与严重疾病有关的隐性等位基因，”他说。“人们已经发现了数百个能够预测疾病的基因，现在也有不少服务可以对它们进行准确的检测。”     
1 V1 ]4 M, R4 |最近， Church 作为共同作者发表了一项新研究。据他介绍，这是首次发表用 NGS  进行携带者筛查的文章，他们的方法“充分提高了质量并且降低了成本”。研究团队使用padlock探针，在194个细胞系中抽出并测序了15个有临床意义的基因，其中55个细胞系来自于携带上述基因突变的个体。     
  y4 t" F/ S! p        下一代测序的另一个新兴的应用领域是单细胞 RNA 测序。“单细胞 RNA 测序能向我们展示，相同细胞中 RNA 表达的天然随机性，这一点非常吸引人。”  Mardis 说。     
' @8 T! _! t7 K0 C6 G+ I* V0 [3 tChurch 介绍到，他即将发表的一篇文章描述了一种新的测序方案，称为荧光原位测序（fluorescent in situ  sequencing）。这一技术将荧光原位杂交和 RNA -Seq结合起来，能够计数并确定不同转录本在组织切片中的空间定位。     
Church 的团队通过荧光原位测序证实，转录本会依据伤口的愈合情况在成纤维细胞中呈不对称分布。     
        这样的数据在十年前简直难以想象。同样，我们也很难想象 NGS 在未来十年又会发生怎样的翻天覆地的变化。