李大力、刘明耀课题组利用CRISPR-Cas9技术建立大、小鼠基因敲除体系

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2013-08-16
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国际著名生物学期刊《Nature Biotechnology》（2012 年影响因子为  32.44）于 8 月 8 日在线正式发表了上海市调控生物学重点实验室、华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀教授和李大力副教授课题组的最新研究成果。这是继今年 6  月该课题组在《Nucleic Acids  Research》杂志发表基因敲除小鼠新技术后，再次在国际著名生物期刊上报道课题组在基因敲除大鼠和小鼠技术上所获得突破和成果。
    基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。刘明耀、李大力课题组一直致力于开发新的构建基因敲除动物技术。今年6月在《Nucleic  Acids  Research》发表了关于转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）的技术论文，成为国内最早掌握该项技术的团队之一，也是世界上最早利用该技术构建基因敲除小鼠的两个团队之一。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas  技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9  核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该课题组迅速将该技术运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过  RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA  注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，该课题组又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA  进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，课题组还证明了利用 CRISPR-Cas  技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体  Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。从设计实验到论文发表，该团队只用了不到  7 个月的时间，充分证明了该技术方法效率之高。
$ n7 @- X1 e! V2 ZCRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN  等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。目前该团队已经利用该项技术为上海市计划生育研究所、上海市东方医院、上海交大和复旦大学等科研单位和医药公司提供了多项动物模型构建的技术服务。
1 [& g  A, [; `1 Y  F$ F    该论文的第一作者为李大力副教授和邱中伟博士研究生，同时参与本项研究的单位还有广西医科大学。本研究工作得到了国家科技部、教育部、国家自然科学基金委以及上海市科委的经费支持。
刘明耀
# q6 p$ M3 ^; q& C  g  K教授，男，1962年生于湖南，1982年获湖南师范大学学士学位，1985年获湖南师范大学硕士学位，1992年获美国马里兰大学 (University of  Maryland, College Park) 细胞生物学博士学位，1993年到1998年先后在美国约翰?霍普金斯大学医学院 (Johns Hopkins  University School of Medicine) 神经科学系和加州理工学院(California Institute of Technology,  Caltech)生物学部做博士后研究。1999年在美国德克萨斯农工大学生物科学和技术研究所 (Institute of Biosciences and  Technology, Texas A&M University)  任助理教授。2003年晋升为终身副教授，2007年晋升为终身教授。刘明耀教授任职于该研究所干细胞与癌生物学中心，并担任德克萨斯农工大学细胞与分子医学系博士导师，同时担任德克萨斯农工大学遗传学部，德克萨斯大学休斯敦健康科学中心和M.D.  Anderson癌症研究中心(University of Texas Houston Health Science Center and University  of Texas M.D. Anderson Cancer Center Graduate School of Biomedical  Sciences)博士导师。2007年受聘为华东师范大学教授，筹建生命医学研究所并任所长。
8 E+ w- ~# k: i7 @: s/ m李大力  
7 T: f1 G1 `* {: F4 u% q' v8 y! @2007年获得美国德州农工大学和湖南师范大学联合培养博士学位，同年受聘于华东师范大学生命科学学院从事教学与科研工作, 于2009  年破格晋升为副教授。目前为华东师范大学转基因动物中心负责人。近年来在国际知名生物学期刊Nucleic Acids Research，Cancer  Research，Development和Endocrinology等杂志上发表研究论文30余篇。主持国家自然科学基金2项，华东师范大学科研创新基金项目1项，同时作为学术骨干参与国家973项目1项，参与省部级课题多项。主要研究方向为：GPCR及其相关信号转导调节因子在生殖发育和组织稳态维持中的功能和调控机理；由于研究的技术手段主要是各类基因修饰小鼠模型，因此同时开展了基因修饰小鼠模型构建的新方法研究。以期在最近建立的快速定点进行小鼠基因编辑技术的基础上能够高效快速构建条件基因敲除小鼠的新方法。
原文检索：
Dali Li, Zhongwei Qiu, Yanjiao Shao, Yuting Chen, Yuting Guan, Meizhen Liu,  Yongmei Li, Na Gao, Liren Wang, Xiaoling Lu, Yongxiang Zhao& Mingyao Liu. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature  Biotechnology, 08 August 2013; doi:10.1038/nbt.2661
Zhongwei Qiu, Meizhen Liu, Zhaohua Chen, Yanjiao Shao, Hongjie Pan, Gaigai  Wei, Chao Yu, Long Zhang, Xia Li, Ping Wang, Heng-Yu Fan, Bing Du, Bin Liu,  Mingyao Liu, and Dali Li. High-efficiency and heritable gene targeting in mouse  by transcription activator-like effector nucleases. Nucl. Acids Res. April 28,  2013; doi: 10.1093/nar/gkt258