基因组编辑新技术：CRISPR–Cas

小丫 · 发表于 2014-3-20 18:42:33

2013-03-07

一种可利用导向RNA分子靶向裂解DNA的细菌酶，一直以来被用作为一种可编程工具，位点特异性修改从细菌、人类细胞到斑马鱼等生物及细胞的基因组。
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。
近期，《科学》（Science）和《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上，接连发表了5篇研究论文，报告了研究人员现在称之为CRISPR–Cas系统的这一细菌序列的应用，它成为了基因组编辑的一个简单通用工具。

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Diagram of the possible mechanism for CRISPR. 来自：维基共享

随着近几十年来全基因组测序常规化，在很多的细菌和古细菌中发现了包含CRISPR序列的区域和CRISPR相关(Cas)基因。发现这些短独特序列能与病毒或质粒DNA序列相匹配，表明CRISPR–Cas系统能够编码“适应性”免疫系统，提供特异防御对抗入侵者。随后的遗传和生物化学实验证实了这一猜测，表明CRISPR–Cas允许检测和防止移动遗传元件。
尽管一些CRISPR–Cas系统需要多种蛋白才能发挥功能，在许多细菌中发现的II型系统却只需利用一种内切核酸酶Cas9。该酶与导向RNA协同作用定位在PAMs保守序列限定的位点，裂解入侵DNA。为了形成功能性的DNA靶向复合物，Cas9需要两种不同的RNA转录物，crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（CRISPR RNA）。然而，近期的研究表明，这样的双RNA可以重新装配成一种单导向RNA （single-guide RNA，sgRNA)，其包含的序列足以编程Cas9，介导靶DNA双链断裂。
新的研究论文表明，RNA导向Cas9可以在多种细胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。这一点使得它具有基因组编辑的潜能。当借助于同源重组或是非同源末端连接，这些标准的细胞修复机制修复双链断裂时，可以此修改修复位点的序列，或插入新的遗传信息。
近期的三项研究证实RNA编程Cas9可以在人类细胞中发挥功能。美国哈佛-麻省理工Broad 研究所、哈佛大学医学院和首尔大学的三个独立研究小组，设计出了来自产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9酶版本，它能在人类细胞核中维持活性。研究人员还设计出了双RNAs或 sgRNAs，它们包含着与人类靶DNA序列互补的20个核苷酸序列。当研究人员在各种人类细胞系中表达这种“人源化” Cas9和导向RNAs时，他们观察到靶DNA发生了预期的改变，介导了双链断裂及随后的修复。这种基因打靶成功率高达38%，只伴随有低水平的Cas9毒性。这种RNA导向Cas9还可有效触发人类细胞中正常基因组位点的靶向性基因置换。
早先的研究发现，单链RNA断裂有利于同源重组，以及减少脱靶突变。基于此，美国哈佛-麻省理工Broad 研究所和哈佛大学医学院研究人员还对Cas9进行测试。发现突变酶非同源末端连接效率较低，但同源重组触发的基因置换和野生型内切核酸酶一样有效。两个小组还进一步证实了该系统在“多路”靶向中的功能；sgRNA编程Cas9可结合两种不同的基因组序列，其表达可导致不止一个靶位点序列断裂。此外，Broad 研究所的研究人员还证实单独表达原来双tracrRNA–crRNA组合中的两个RNA元件，基因破坏效率能够进一步提高。这一研究发现表明改良sgRNAs或许可使它们更好地模拟双RNA结构。
除了这些在细胞系中获得的研究结果，洛克菲勒大学的研究人员还利用RNA导向的Cas9操纵了完整生物体的基因组。他们证实通过在单细胞中采用不同的几种导向RNA编程Cas9，可在细菌中使用这一系统修改多个位点。此外，麻省总医院的研究人员证实将Cas9编码mRNA和适当的导向RNAs注入到单细胞期胚胎中，在所有测试胚胎中导致了10个位点中的8个发生了高频率(24–59%)的靶向性插入和删除。这些研究结果表明，RNA导向Cas9可能能够用于操纵其他的多细胞生物，包括哺乳动物和植物。该技术另一个最让人感到兴奋的潜在应用是，为生成人类疾病动物模型提供了一种简单的方法。
利用RNA可编程Cas9进行基因组操作，有望广泛应用于合成生物学、直接和多路干扰基因网络，体内外靶向性基因治疗。下一个挑战将是分析和解决可能出现的脱靶效应，提高系统效率和特异性，扩大应用到其他生物体。就这方面而言，比较RNA编程Cas9与现有的基因编辑工具，包括大范围核酸酶、ZFNs和TALENs将具有极重要的意义。除了基因组编辑，这一方法可为利用失活性Cas9导致转录性基因沉默，或工程操作Cas9获得转录激活等新功能提供了可能性。限制性酶和耐热聚合酶等细菌系统的发现及应用，在过去彻底改变了分子生物学。有了RNA导向Cas9酶，细菌现在为我们提供了重新基因组序列信息的一个通用工具，其具有在生物技术和医学中改造基因组工程景观的潜力。
了解更多：
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. DOI: 10.1126/science.1231143
RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. DOI: 10.1126/science.1232033
A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. DOI:doi:10.1038/nbt.2517
RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. DOI:doi:10.1038/nbt.2508
Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. DOI:doi:10.1038/nbt.2501

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