[转]植入前遗传学诊断技术

小丫

        植入前遗传学诊断（Preimplantation Genertic Diagnosis PGD）是辅助生育技术与分子生物学技术相结合而发展的产前诊断技术，俗称第三代试管婴儿。PGD主要是对体外受精的胚胎进行遗传学诊断，在确定正常后再将胚胎植入子宫。检测物质主要是取4～8个细胞期胚胎的1个细胞或受精前后的卵第一、二极体，取样不影响胚胎发育。
$ k; ?, p; @# ]1 j6 J( q        由于此技术是通过人工手段排除带有遗传性疾病及其隐患的受精胚胎，优选出健康的胚胎，再移植入子宫进行正常孕育。不仅可以治疗不孕症，在阻断遗传病传播、降低人类遗传负荷上都具重要意义，因此，它实际上是一项以“优生优育”为目的生殖医学技术。目前根据遗传物质发生变化的方式不同，可将PGD技术归为4类：染色体分析、DNA分析、RNA分析和蛋白质分析。
一、染色体分析
　　染色体数目或结构发生变化，可能导致某种综合征。通常伴有发育畸形和智力低下，它也是导致流产与不育的重要原因，其发病率较高。目前统计有0.5%～0.7%的活产儿、75%的胎儿有染色体畸变，同时体外受精获得的胚胎染色体异常高达30%。因此植入前对染色体进行分析，一方面，为高质量胚胎的筛选提供依据，以利于提高植入率；另一方面，可以避免性染色体异常以及三体患儿出生。
　　染色体分析普遍采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）。可以在植入前对多倍体、异倍体胚胎进行筛查,如21三体(先天愚型)、11三体、13三体(Ｐａｔａｕ综合征)、18三体(Ｅｄｗａｒｄｓ综合征)。ＦＩＳＨ在鉴定胚胎性染色体是否异常上具有独到之处,如多Ｘ(Ｔｕｒｎｅｒ综合征、Ｋｌｉｎｅｆｅｃｔｅｒ综合征)、多Ｙ(ＸＹＹ综合征)以及性染色体片段易位导致的性别异常、性逆转等只能采用ＦＩＳＨ技术,采用ＰＣＲ技术无法检测出来。另外,在植入前可发现平衡易位(ｂａｌａｎｃｅｄｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ),避免由其导致的反复流产。一些Ｘ连锁、Ｙ连锁性疾病,则需鉴定胚胎性别后,植入女性胚胎。
　　二、DNA分析
2 M# V; T; I2 K0 l7 j: x　　迄今有1 000多种遗传病的基因被定位。DNA分析主要是检测单基因遗传病。目前主要是采用聚合酶链反应(PCR)技术。
+ }+ R6 `* D2 q7 _/ L$ d3 D2.1 单基因遗传病的ＰＧＤ：一些常见病如血友病、β地中海贫血、新生儿溶血、镰刀型细胞贫血、肌营养不良、软骨发育不全、多指、脊髓小脑共济失调Ⅰ型、遗传性肾炎 、囊性纤维病、黑朦白痴等都属单基因遗传病,其致病基因及突变位点特征都比较清楚,目前检测的方法都是以ＰＣＲ为基础。
　 进行PGD时，以单细胞为反应模板，PCR的功效受到限制，因此采用多种改进的PCR法。如：引物延伸预扩增、原位PCR、免疫PCR、荧光标记定量PCR、等位基因特异性扩增、微卫星DNA的PCR及甲基化特异PCR等。
; ?5 e  e3 W2 J. i* {DNA分析往往以已知基因序列为前提，人类基因突变数据库（human genome mutation database，HGMD）为其提供了便利条件。HGMD包括已发表的碱基替换、缺失、复制、插入及重排等突变，可在世界广域网上共享，通过上网便可查询遗传病基因突变的数据信息。
. f( b8 f6 I6 N# z' X) @0 p7 T2.2多基因遗传病的ＰＧＤ：由于多基因遗传病其分子机理尚不十分清楚,受多个微效基因及环境因素影响,因此给诊断带来很大困难。ＰＧＤ必须建立在家系诊断基础上,必须有多个家系样本做参照,才能做出正常诊断和预后评估。已知多基因病为一些常见出生缺陷,如神经管缺陷(ＮＴＤ),包括无脑儿和脊柱裂,以及一些常见病如高血压、动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、哮喘、精神分裂症、躁狂抑郁症等。
　　三、RNA分析
　　目前此技术主要采用以下两种方法，但运用较少。
　　3.1 逆转录PCR（reverse transcription and polymerase chain reaction，RT-PCR）：将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行扩增，来检测目的基因。目前已将该法应用于Marfan综合征患者的PGD。
　　3. 2 基因表达的微点阵分析：卵裂球细胞染色体改变、异常发育或发生细胞凋亡，RNA表达会发生变化。目前正在研究的一种新技术---微点阵分析（microarray assay），即将人类已知基因的cDNA用荧光标记，与滴加待测样品的点阵玻片杂交，通过扫描器测定荧光光谱，借助计算机软件定量检测基因表达，1 d内可检测几千个基因的活性。此项工作还未应用于PGD，是一项前景可观、有待开发的领域。
, t+ [4 ?& D9 Y0 @) ?3 T2 t　　四、蛋白质分析
　　 蛋白质与生物特性直接相关，对蛋白质分析是PGD的另一个方向。被称为“临床分子扫描器”的质谱仪，可用于细胞抽提物中蛋白质2D凝胶斑点鉴定。在电泳过程中，根据电荷和分子大小，细胞内蛋白质呈现由1 000～3 000个斑点组成的特征图谱，其中每个斑点代表1个蛋白，斑点图谱可显示蛋白质含量，还显示其是否进行了翻译后修饰。图谱的变化往往反映出某种疾病，尤其是蛋白质翻译后修饰发生变化被认为是导致疾病的征兆。关于植入前胚胎细胞蛋白组的研究，目前尚无报道。
* Q* x. @! q( j　　五、其他技术
# z+ |; p; E0 k6 P6 O　　 少精、寡精患者通过体外受精或细胞质内单精子注射（introcytoplasmic sperm injection，ICSI）技术，可以获得后代，甚至无精者通过附睾、睾丸穿刺也可以得到自己的孩子，但子代仍面临不育可能。因为5%～20%的无精和寡精是由基因缺陷造成的，如Y染色体上的单拷贝基因——缺失型无精子基因(DAZ）和多拷贝基因——RNA结合修饰基因(RBM）家族片段缺失。建议此类患者植入女性胚胎，另外对于Y-连锁性疾病，也需要植入女性胚胎。因此，需尝试在受精前筛选出X精子。由于FISH或PCR法检测精子具有破坏性,不能再用于受精。因此可利用一种无毒性且在细胞内只暂短停留的荧光染料染精子，由于X和Y精子核质量不同，可经流式细胞仪分开，其受精率在65%以上。
% |9 T- `" h0 C2 Y1 ]0 S　　 DNA芯片技术是近年来发展起来的新技术，具有快速、准确、低耗的特点。利用此技术可以在基因组水平上进行表达、突变和多态性分析以及遗传制图和序列测定，现已应用于人类疾病的诊断。相信不久，在芯片上对某一患者的全部基因组的遗传分析将成为常规。